重組β-瓊脂糖酶ⅠDagA的原核表達(dá)及活性鑒定.pdf

1、瓊脂糖酶能夠特異性降解瓊脂糖，在很多方面有重要應(yīng)用。瓊脂糖酶能降解瓊脂產(chǎn)生瓊脂寡糖，瓊脂寡糖具有多種特殊功能而引起人們越來越多的關(guān)注。瓊脂糖降解菌主要存在于海洋中，來源有限，限制了瓊脂糖酶的大規(guī)模應(yīng)用。拓寬瓊脂糖酶的來源，特別是采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)瓊脂糖酶，對大力推廣瓊脂糖酶的應(yīng)用及開發(fā)瓊脂糖酶酶解產(chǎn)物中具有活性功能物質(zhì)的應(yīng)用具有一定的價值和意義。 原核表達(dá)系統(tǒng)是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。pET系統(tǒng)是在E．coli中克隆表達(dá)重

2、組蛋白的功能最強大的系統(tǒng)。故本研究采用常用的pET及大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，試圖獲得大量目的蛋白。1996年NCBI公布了來自Pseudoalteromonax atlantica的β-瓊脂糖酶Ⅰ全基因序列dagA(M73783)，但對β-瓊脂糖酶Ⅰ DagA高效表達(dá)的研究目前尚未見報道。比較目前報道的多種β-瓊脂糖酶，可以看出盡管不同來源的β-瓊脂糖酶的功能相似，但它們在氨基酸序列、分子量、底物特異性、反應(yīng)特性等方面存在著很大的差異。為

3、了開發(fā)和應(yīng)用β-瓊脂糖酶ⅠDagA，本文克隆β-瓊脂糖酶Ⅰ基因dagA，采用共表達(dá)分子伴侶的方法，提高目的蛋白表達(dá)效率，為構(gòu)建B·瓊脂糖酶穩(wěn)定的原核高效表達(dá)系統(tǒng)奠定實驗基礎(chǔ)。獲得的主要研究結(jié)果如下： 1.從Pseudoalteromonas atlantica 19262基因組DNA克隆出β-瓊脂糖酶Ⅰ全基因dagA及切除信號肽序列的編碼序列dagA(▽)，通過構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)化、篩選鑒定獲得了重組DagA高表達(dá)菌株ER2566-p

4、ET21a-dagA(▽)-DsbC和ER2566-pET21a—dagA(▽)-FkpA，成功地實現(xiàn)了β-瓊脂糖酶ⅠDagA在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。 2.對包涵體形式表達(dá)DagA的重組菌ER2566-pET21a-dagA(▽)-DsbC的培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高了包涵體的產(chǎn)量，并對包涵體復(fù)性的條件進(jìn)行了初步的探索。通過優(yōu)化重組菌ER2566-pET21a-dagA(▽)-FkpA的誘導(dǎo)條件實現(xiàn)了重組DagA的分

5、泌表達(dá)，為β-瓊脂糖酶ⅠDagA的深入研究和工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。 3.研究了dagA基因中信號肽序列及分子伴侶DsbC、FkpA對重組DagA表達(dá)的影響。在不同宿主菌中采用相同的載體及分子伴侶，但僅在ER2566成功實現(xiàn)了DagA的大量包涵體形式表達(dá)和分泌表達(dá)。切除信號肽序列的dagA(▽)，添加ATG啟動子，在大腸桿菌菌株ER2566體內(nèi)可明顯提高目的蛋白的表達(dá)。共表達(dá)分子伴侶DsbC未能提高DagA的分泌表達(dá)，推測

6、是表達(dá)出的DsbC以無活性形式存在，在菌體內(nèi)未能起到分子伴侶作用所致，而分子伴侶FkpA．則在ER2566菌株中明顯提高了目的蛋白的分泌表達(dá)。 4.初步研究了重組β-瓊脂糖酶ⅠDagA的活性和酶學(xué)性質(zhì)。在pH4.8～pH6.8范圍內(nèi)，酶活性保持60％以上，最適pH約為5.8；在溫度37～60℃均有活性，最適溫度為55℃，與其他國內(nèi)報道的β-瓊脂糖酶相比，最適溫度提高了10℃以上。NaCI、MgCl2、CaCl2鹽溶液對DagA酶