γ-生育酚改善db-db小鼠血管功能及其作用機(jī)制.pdf

1、研究背景:內(nèi)皮功能障礙是多種代謝性疾病的一種特性，是早期血管功能障礙的一個(gè)關(guān)鍵事件。氧化應(yīng)激是引起內(nèi)皮功能障礙的重要機(jī)制之一。維生素 E是細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)中主要的脂溶性成分。許多臨床研究以α-生育酚的形式補(bǔ)充維生素 E，作為一種改善內(nèi)皮功能和降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，但是效果并不明確。近年來一些臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，γ-生育酚可能是維生素 E實(shí)際上的保護(hù)性亞型，通過不同機(jī)制起到心血管保護(hù)作用。
　　內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是

2、血管一氧化氮（NO）的主要來源，也是一個(gè)具有抗炎作用的細(xì)胞保護(hù)分子。在糖尿病和與胰島素抵抗相關(guān)的心血管疾病如高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化中都存在 NO的生物利用度減少的現(xiàn)象。因此，改善內(nèi)皮細(xì)胞NO生物利用度將對(duì)緩解/治療內(nèi)皮功能障礙相關(guān)心血管疾病有重要意義。γ-生育酚可以上調(diào)eNOS并促進(jìn)NO形成，可能在防治血管內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮重要作用。
　　雖然親脂性的γ-生育酚有直接的抗氧化和抗炎作用，但它很容易在肝臟以細(xì)胞色素P450（CYP45

3、0）依賴的方式代謝成其生理水基代謝物γ-2-（2'-羧乙基）羥基苯并二氫吡喃（γ-CEHC）。雖然以往的研究支持γ-生育酚自身在嚙齒動(dòng)物和人類的有利影響，但對(duì)其生理代謝產(chǎn)物γ-CEHC的作用尚并不清楚。有限的證據(jù)表明，γ-CEHC可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥刺激時(shí)的炎性反應(yīng)，然而，γ-CEHC是否可以在糖尿病和/或代謝綜合征等高血糖條件下改善內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS信號(hào)尚不清楚。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　1.明確γ-生育酚是否通過激活eNO

4、S/NO信號(hào)通路和降低炎癥反應(yīng)，改善高血糖引起的內(nèi)皮功能障礙。
　　2.闡明γ-生育酚保護(hù)血管功能的具體機(jī)制，尤其是其代謝產(chǎn)物γ-CEHC在其中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組：（1）正常對(duì)照組（CON），8周齡正常野生型C57Bl/6小鼠，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料（Research Diets Inc., New Brunswick, NJ）喂養(yǎng)，含10％脂肪，70%碳水化合物和20%蛋白（kCal）；（2）db/db

5、小鼠組（db/db），db/db小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)；（3）db/db小鼠+γ-生育酚組（db/db+γ-T），db/db小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，并按照γ-生育酚500 mg/kg體重的比例給予。經(jīng)過1周適應(yīng)環(huán)境后，所有小鼠都按照上述條件喂養(yǎng)8周。8周后檢測各組小鼠的代謝指標(biāo)和心血管表型。
　　2.離體觀察外周血管收縮舒張功能：制備股動(dòng)脈環(huán)（內(nèi)徑約150μm）檢測血管反應(yīng)性。給予氯化鉀（KCl）誘導(dǎo)血管最大張力（Lmax），用苯腎上腺素

6、（PE,1μM）使血管環(huán)預(yù)收縮65%的Lmax張力，分別給予乙酰膽堿（ACh,10-8-10-6 mol/L）、硝普鈉（SNP,10-9-10-4 mol/L）檢測內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性血管舒張的劑量反應(yīng)曲線。分別給予PE（10-9-10-4 mol/L）、KCl（20-100 mM）檢測受體依賴性和非受體依賴性血管收縮的劑量反應(yīng)曲線。給予NOS抑制劑（L-NAME），檢測各組小鼠血管的收縮反應(yīng)。
　　3.培養(yǎng)牛主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)

7、胞（BAECs）：在培養(yǎng)基中添加35 mM葡萄糖孵育48 h制造高糖模型，同時(shí)給予生理濃度的γ-生育酚（1.2μM），處理結(jié)束前10 min給予100 nM胰島素，處理結(jié)束后收集細(xì)胞分別用免疫印跡方法、q-RT PCR方法和ELISA方法探討γ-生育酚的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　4.人主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）細(xì)胞培養(yǎng)：使用生理濃度的γ-CEHC（3μM）對(duì)HAECs預(yù)處理24 h，再在培養(yǎng)基中添加20 mM葡萄糖制造高糖模型孵

8、育48 h，處理結(jié)束前10 min給予100 nM胰島素，處理結(jié)束后收集細(xì)胞分別用免疫印跡方法、q-RT PCR方法和ELISA方法觀察γ-CEHC的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　5.采用免疫印跡方法檢測 eNOS， p-eNOSSer1177， Akt， p-AktSer473， ERK， p-ERKThr2023/Tyr204，AMPK，p-AMPKThr172，GSK3β，p-GSK3βSer9，ACC，p-ACCSer79，硝基酪

9、氨酸和eNOS dimers/monomers的蛋白表達(dá)水平。
　　6.采用q-RT PCR方法檢測細(xì)胞粘附因子（ICAM），血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1），E-Selectin，單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）的基因表達(dá)水平。
　　7.采用ELISA方法檢測細(xì)胞內(nèi)NO和ROS的水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組相比，db/db組小鼠的體重、肝臟和脂肪的重量顯著增加，給予

10、γ-生育酚的db/db小鼠體重下降但是肝臟和脂肪的重量不變；與對(duì)照組相比， db/db組小鼠的禁食后血糖、HDL和甘油三酯顯著增高，給予γ-生育酚對(duì)這些指標(biāo)無影響；在各組實(shí)驗(yàn)小鼠中，心臟重量和總膽固醇量無顯著變化。
　　2.與對(duì)照組相比，db/db組小鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能顯著降低，給予γ-生育酚后得到恢復(fù)。各組小鼠之間血管的非內(nèi)皮依賴性舒張、受體介導(dǎo)的收縮和非受體介導(dǎo)的收縮無顯著差異。與對(duì)照組相比，db/db組小鼠通過L-NAME

11、誘發(fā)的血管收縮顯著降低，給予γ-生育酚后得到恢復(fù)。股動(dòng)脈起始寬度，結(jié)束寬度，長度，最大靜息張力，內(nèi)皮依賴性舒張百分比，非內(nèi)皮依賴性舒張百分比和給予NOS抑制劑后的舒張百分比，各組之間無顯著差異。
　　3.與對(duì)照組相比，db/db組小鼠血管eNOSSer1177的磷酸化水平顯著降低，給予γ-生育酚后得到恢復(fù)。與對(duì)照組相比，db/db組小鼠血管 AktThr308的磷酸化水平，AMPKThr172的磷酸化水平和ERK1/2Thr202

12、/Tyr204的磷酸化水平，各組之間無顯著差異。
　　4.與對(duì)照組相比，高糖組胰島素刺激引起的eNOSSer1177的磷酸化水平和NO水平都顯著降低，給予γ-生育酚預(yù)處理后得到恢復(fù)。在不同的處理組之間，基礎(chǔ)的eNOSSer1177的磷酸化水平和NO水平無顯著差異。
　　5.與對(duì)照組相比，高糖孵育48 h后，BAECs中總ROS-RNS水平顯著增加；給予γ-生育酚處理能降低高糖引起的ROS-RNS水平，使總ROS-RNS水平恢

13、復(fù)至對(duì)照組水平。與對(duì)照組相比，高糖能顯著增加炎癥因子和粘附因子的表達(dá)；但是，給予γ-生育酚處理能顯著降低高糖引起的炎癥因子增高。
　　6.與對(duì)照組相比，高糖組胰島素刺激引起的 eNOSSer1177的磷酸化水平，AktSer473的磷酸化水平和NO水平都顯著降低；給予γ-CEHC預(yù)處理后得到恢復(fù)。在不同的處理組之間，基礎(chǔ) eNOSSer1177的磷酸化水平和 NO水平無顯著差異。AMPKThr172的磷酸化水平，ERK1/2Thr

14、202/Tyr204的磷酸化水平，GSK3βSer9的磷酸化水平和ACCSer79的磷酸化水平各組之間無顯著差異。
　　7.與對(duì)照組相比，高糖孵育48 h后，HAECs中總ROS-RNS水平和硝基酪氨酸蛋白表達(dá)顯著升高；給予γ-CEHC預(yù)處理能阻止高糖引起的ROS-RNS水平增加，使總ROS-RNS水平與對(duì)照組類似。與對(duì)照組相比，高糖孵育48 h后，HAECs中eNOS解偶聯(lián)顯著增加；給予γ-CEHC預(yù)處理能防止高糖引起的eNOS

15、解偶聯(lián)，使eNOS保留一個(gè)正常的二聚體與單體的比例。
　　8.與對(duì)照組相比，高糖能顯著增加炎癥因子和粘附因子（ICAM, VCAM-1, E-Selectin, MCP-1和 IL-8）的基因表達(dá)。給予γ-CEHC預(yù)處理能顯著降低高糖引起的ICAM, VCAM-1, E-Selectin, MCP-1和IL-8基因表達(dá)增高。
　　結(jié)論:
　　1.γ-生育酚可以改善高血糖所致的血管功能障礙；
　　2.γ-生育酚通過