重組人卵透明帶ZP3蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)和純化.pdf

1、　　透明帶(ZP)是哺乳類動(dòng)物卵細(xì)胞膜外包被的一層特殊的非細(xì)胞結(jié)構(gòu),是精子與卵細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合的部位。人卵透明帶蛋白ZP3是精卵識(shí)別和結(jié)合過程中的初級(jí)精子受體,因而成為研究孕前型避孕疫苗的潛在靶抗原。體內(nèi)自身透明帶抗體的存在會(huì)導(dǎo)致卵巢功能紊亂、不孕以及流產(chǎn)等病變。透明帶誘發(fā)精子頂體反應(yīng)率還可作為精子功能評(píng)價(jià)指標(biāo)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,為了得到大量高純度的透明帶抗原進(jìn)行深入的抗生育疫苗和免疫不孕診斷研究的需要,國(guó)內(nèi)外科研人員都紛紛通過基因

2、工程途徑生產(chǎn)透明帶蛋白,并克隆了多種哺乳動(dòng)物卵透明帶的cDNA,包括人ZP3的cDNA。利用基因重組的方法可在體外較大量生產(chǎn)人卵透明帶ZP3蛋白,為抗生育研究和不育癥的診斷提供可靠且成本低廉的研究蛋白。
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)人ZP3蛋白編碼第23~第408位氨基酸的cDNA序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,正向引物含6個(gè)組氨酸基因序列和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn),反向引物含Not Ⅰ酶切位點(diǎn)；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pPIC9K各自經(jīng)EcoR

3、 Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切后,用T4 DNA連接酶連接起來,然后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α；在含氨芐青霉素的LB板上挑取單菌落,用煮沸法快速鑒定陽性轉(zhuǎn)化子,并用雙酶切和測(cè)序方法鑒定質(zhì)粒。抽提大量重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒線性化后電打孔導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞,在組氨酸缺陷的MD板上篩選陽性克隆。然后用不同濃度的G418-YPD培養(yǎng)液篩選目的基因多拷貝插入的酵母轉(zhuǎn)化子。再通過小瓶培養(yǎng),SDS-PAGE和Western blotting鑒定選出高表達(dá)的的轉(zhuǎn)化菌株。

4、將此菌株在發(fā)酵罐里擴(kuò)大培養(yǎng),從培養(yǎng)液上清里用親和層析的辦法分離純化人卵透明帶ZP3蛋白。
　　PCR擴(kuò)增的目的基因片段能重組到載體pPIC9K中,用PCR法快速鑒定陽性克隆,也證實(shí)目的基因片段正確插入了載體,測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)人卵透明帶ZP3蛋白基因成功克隆進(jìn)了表達(dá)載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母后,篩選出多拷貝插入宿主染色體的單克隆,經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng),以及SDS-PAGE和Western blotting分析,有一表觀分子量為32~43KD