斜紋夜蛾核型多角體病毒日本株ie0、ie1基因和25k基因結(jié)構(gòu)和功能的初步研究.pdf

1、斜紋夜蛾核型多角體病毒(Spodoptera litura multicapsid：nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV)屬NPV科A亞群。國內(nèi)于1972年在廣州地區(qū)首次從野外死亡的斜紋夜蛾蟲體分離到這種病毒。其宿主斜紋夜蛾(Spodoptera litura，Spli)是鱗翅目夜蛾科的雜食性害蟲，分布范圍廣，是我國糧棉、油等經(jīng)濟(jì)作物和蔬菜的重要害蟲之一。應(yīng)用SpltMNPV防治斜紋夜蛾是一種有效的生物防治方法，而

2、通過基因工程手段構(gòu)建新的高效殺蟲病毒是改良生物病毒殺蟲劑的重要途徑。從分子水平深入地闡明SpltMNPV在體內(nèi)的侵染、增殖規(guī)律、建立SpltMNPV載體表達(dá)系統(tǒng)是達(dá)到上述目的的理論基礎(chǔ)和技術(shù)準(zhǔn)備。因此，近年來對SpltMNPV的研究受到廣泛關(guān)注，有關(guān)該病毒的序列測定、基因結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控等分子生物學(xué)研究工作進(jìn)展迅速，特別是對一些重要基因的結(jié)構(gòu)分析，有助于篩選毒力較強(qiáng)的殺蟲毒株，并為這一病毒殺蟲劑的改良和發(fā)展以及組建昆蟲桿狀病毒表達(dá)載

3、體奠定基礎(chǔ)。本研究在Spli-SpltMNPV的模型中對ieO/iel及25k基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)與功能的初步研究，主要工作及成果如下： 1．克隆并表達(dá)了SpltMNPV日本C3株ie0基因，該基因編碼區(qū)含864bp核苷酸，編碼分子量為33124D的多肽(GenBank登陸號：AY 727987)。分析了該基因的核苷酸和氨基酸序列特征，進(jìn)行了IE0蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測以及分子系統(tǒng)發(fā)育分析。序列分析發(fā)現(xiàn)，在SpltMNPV IE0蛋白N-

4、端23-47位以及111-126位富含酸性氨基酸和疏水性氨基酸殘基，C-端第225-271位具有典型的CX<,2>CX<,14>CCX<,4>CX<,2>CX<,15>CX<,2>C雙鋅指基序，該結(jié)構(gòu)在所比較的9種昆蟲核型多角體病毒IE0蛋白中是十分保守的。將ie0基因克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE顯示該蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了表達(dá)，同時進(jìn)行了western blot鑒定。

5、 2．構(gòu)建了以GFP為標(biāo)記的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSplt-ieO和pSplt-ie1，使用能直接被宿主細(xì)胞識別的極早期基因ie0和ie1的啟動子。將pSplt-ie0和pSplt-ie1轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，瞬時表達(dá)的IE0和IE1蛋白能引起非宿主細(xì)胞的凋亡。結(jié)合三種凋亡抑制劑對SpltMNPV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，對IE0和IE1蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，IE0和IE1蛋白能夠引起非宿主細(xì)胞的凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的能力與其瞬時表達(dá)的

6、量呈正相關(guān)，但有一閾值。其引起凋亡的途徑可能是由于IE0和IE1蛋白的表達(dá)引起了細(xì)胞DNA的非正常復(fù)制。 3．首次在SpltMNPV中發(fā)現(xiàn)了少多角體的遺傳變異株?？寺×薙pltMNPV日本株A、B、C型的25k基因，與SpltMNPV中國株的核苷酸和氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，由于B型25k基因3′端核苷酸的缺失和插入，導(dǎo)致25k蛋白C端21個氨基酸的改變，引起了多角體明顯減少的表型。B型病毒在感染幼蟲后期不能使蟲體正常降解和液化，推