法舒地爾對碘克沙醇致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦且环N常見病多發(fā)病，冠狀動(dòng)脈造影技術(shù)及冠脈CTA是冠心病診斷的常用方法，對比劑的使用也日益增多。較多研究發(fā)現(xiàn)，對比劑可以引起腎臟損傷，其機(jī)制目前尚不明確，有研究顯示，非等滲對比劑可通過破壞細(xì)胞形態(tài)對腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷。隨著等滲對比劑的出現(xiàn)，雖然滲透壓造成的腎臟損傷被避免，但是等滲對比劑的使用并未完全減少腎臟損傷的發(fā)生。為進(jìn)一步探索腎臟損傷機(jī)制，有學(xué)者過對比造影劑干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，等滲對比劑可以

2、引起血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌一氧化氮(NO)異常，還有研究發(fā)現(xiàn)等滲對比劑可促成內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而推斷等滲對比劑通過損傷腎小球內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而引起腎臟損傷。但是等滲對比劑引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚不明確，這無疑為對比劑腎損傷的預(yù)防帶來困惑。
　　RhoA/ROCK通路是常見的炎性機(jī)制，它參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，包括高血壓、肺動(dòng)脈高壓、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈痙攣、肥厚型心肌病、糖尿病等，亦可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bax、Bcl-2同屬于凋亡蛋白，Bax

3、增高會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，會(huì)抑制Bax的促凋亡作用，Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)降低或Bax/Bcl-2比值增高則預(yù)示細(xì)胞凋亡增加。
　　本實(shí)驗(yàn)通過使用等滲對比劑（碘克沙醇）干預(yù)HUVEC，測定HUVEC表達(dá)ROCK-1、Bax、Bcl-2蛋白含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn):碘克沙醇干預(yù)后的HUVEC表達(dá)ROCK-1蛋白明顯增加，且有濃度依賴性，受損的HUVEC表達(dá)Bcl-2降低，Bax/Bcl-2比值增加，由此初步推斷碘

4、克沙醇可以干預(yù)RhoA/ROCK-1通路從而引起細(xì)胞凋亡。
　　為了進(jìn)一步證明前述推斷，將碘克沙醇干預(yù)后的HUVEC給予ROCK抑制劑法舒地爾干預(yù)，測定HUVEC的ROCK-1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):法舒地爾干預(yù)后的HUVEC的ROCK-1表達(dá)減少，Bcl-2表達(dá)增多，Bax/Bcl-2比值減低。
　　綜上所述，碘克沙醇引起HUVEC凋亡是通過RhoA/ROCK-1通路產(chǎn)生作用的，為預(yù)防碘克沙醇損傷內(nèi)皮細(xì)胞

5、及損傷后保護(hù)提供了理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 RhoA/ROCK-1通路在碘克沙醇損傷HUVEC中的作用及其機(jī)制
　　目的:探索RhoA/ROCK-1通路在碘克沙醇干預(yù)HUVEC過程中的作用及碘克沙醇對HUVEC Bax/Bcl-2表達(dá)的影響，進(jìn)而研究碘克沙醇促進(jìn)HUVEC凋亡的機(jī)制。
　　方法:將原代HUVEC傳至2-3代，將細(xì)胞分為A（空白組）、B(5％碘克沙醇干預(yù)組(16mg/ml))、C(10％碘克沙醇干預(yù)組(3

6、2mg/ml)、D(15％碘克沙醇干預(yù)組(48mg/ml))、E(20％碘克沙醇干預(yù)組(64mg/ml)五個(gè)組，分別用含有10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基、16mg/ml碘克沙醇+10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基、32mg/ml碘克沙醇+10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基、48mg/ml碘克沙醇+10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基、64mg/ml碘克沙醇+10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2h、4h、10h、24h。
　　測定如下指標(biāo):1、通過聚光

7、顯微鏡觀察不同組別HUVEC生長形態(tài);2、CCK8方法測定不同組別不同時(shí)間段OD值，繪制不同組別生長曲線，計(jì)算不同組別的HUVEC死亡率;3、Western-Blot檢測不同組別HUVEC ROCK-1、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá);4、RT-PCR檢測不同組別HUVEC ROCK-1、Bax/Bcl-2表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.碘克沙醇對HUVEC形態(tài)的影響:與對照組相比，碘克沙醇干預(yù)組HUVEC形態(tài)明顯損傷，且濃度越高，

8、細(xì)胞損傷越重。
　　2.碘克沙醇對HUVEC生長速率及死亡率的影響:與對照組相比，碘克沙醇干預(yù)組生長速率明顯下降，且在培養(yǎng)10h后及濃度增高時(shí)明顯，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性及濃度依賴性;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，計(jì)算與初始OD值的差值計(jì)算細(xì)胞死亡率，相比對照組，碘克沙醇干預(yù)組死亡率明顯增加，且隨著碘克沙醇濃度增加，死亡率逐漸增加，呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著時(shí)間延長，死亡率逐漸增加，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。
　　3.碘克沙醇對HUVEC RhoA/ROCK

9、-1、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響:相比對照組，碘克沙醇干預(yù)后的HUVEC表達(dá)ROCK-1蛋白明顯增加，且有濃度依賴性;相比對照組，碘克沙醇干預(yù)組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯下降，且有濃度依賴性;計(jì)算Bax/Bcl-2比值，相比對照組，碘克沙醇干預(yù)組Bax/Bcl-2比值明顯增加，且有濃度依賴性。
　　小結(jié):碘克沙醇干預(yù)HUVEC過程中，形態(tài)上，碘克沙醇對HUVEC造成明顯損傷，且有濃度依賴性;細(xì)胞數(shù)量上，碘克沙醇明顯抑制HUVE

10、C生長，促進(jìn)HUVEC死亡，且有濃度依賴性;機(jī)制上，碘克沙醇通過影響RhoA/ROCK-1通路，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，同時(shí)，通過影響B(tài)ax、Bcl-2表達(dá)，引起B(yǎng)ax/Bcl-2比值變化，導(dǎo)致HUVEC凋亡。
　　第二部分法舒地爾通過抑制RhoA/ROCK-1通路對碘克沙醇損傷HUVEC的保護(hù)作用及對Bax/Bcl-2表達(dá)的影響
　　目的:探索法舒地爾通過抑制RhoA/ROCK-1途徑，進(jìn)而影響B(tài)ax/Bcl-2表達(dá)，以達(dá)到對碘克沙

11、醇損傷HUVEC的保護(hù)作用。
　　方法:將原代HUVEC傳至1-2代后，將細(xì)胞分為A（空白組）、B(10％碘克沙醇干預(yù)組(32mg/ml)、C(10％碘克沙醇(32mg/ml)+50umol/L法舒地爾干預(yù)組）、D(10％碘克沙醇(32mg/ml)+100umol/L法舒地爾干預(yù)組）四個(gè)組，分別用含有10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基、32mg/ml碘克沙醇+10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基、32mg/ml碘克沙醇+10％胎牛血清+50um

12、ol/L法舒地爾DMEM培養(yǎng)基、32mg/ml碘克沙醇+10％胎牛血清+100umol/L法舒地爾DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2h、4h、8h、24h。
　　測定如下指標(biāo):1、通過聚光顯微鏡觀察不同組別HUVEC生長形態(tài);2、CCK8方法測定不同組別不同時(shí)間段OD值，繪制不同組別生長曲線，計(jì)算不同組別的HUVEC死亡率;3、Western-Blot檢測不同組別HUVEC ROCK-1、Bax/Bcl-2表達(dá);4、RT-PCR檢測不同組別

13、HUVEC ROCK-1、Bax/Bcl-2表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.法舒地爾對碘克沙醇損傷HUVEC形態(tài)的影響:與對照組相比，碘克沙醇干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)明顯損傷，但法舒地爾干預(yù)組HUVEC細(xì)胞形態(tài)明顯改善，且有濃度依賴性。
　　2.法舒地爾對碘克沙醇干預(yù)HUVEC生長速率及死亡率的影響:與對照組相比，碘克沙醇干預(yù)組生長速率下降，法舒地爾干預(yù)組生長速率較損傷組增加，且有濃度依賴性;計(jì)算與初始OD值的差值計(jì)算細(xì)胞死亡率，相

14、比碘克沙醇干預(yù)組，法舒地爾保護(hù)組死亡率降低，且呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　3.法舒地爾隊(duì)碘克沙醇干預(yù)HUVEC后RhoA/ROCK-1、Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響:相比對照組，碘克沙醇干預(yù)組表達(dá)ROCK-1蛋白表達(dá)明顯增加，法舒地爾干預(yù)組ROCK-1蛋白表達(dá)較損傷組減少，且隨著法舒地爾濃度的增加，ROCK-1蛋白表達(dá)明顯減少，呈現(xiàn)濃度依賴性;相比對照組，碘克沙醇干預(yù)組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯下降，法舒地爾干預(yù)組較損傷組Bcl-2蛋

15、白表達(dá)增加，且隨著法舒地爾濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加，呈現(xiàn)濃度依賴性;計(jì)算Bax/Bcl-2比值，相比對照組，碘克沙醇干預(yù)組Bax/Bcl-2比值明顯增加，法舒地爾干預(yù)組較損傷組Bax/Bcl-2比值明顯下降，且有濃度依賴性。
　　小結(jié):法舒地爾可以明顯改善碘克沙醇對HUVEC造成的細(xì)胞形態(tài)損傷，且有濃度依賴性;法舒地爾可以促進(jìn)碘克沙醇損傷后HUVEC的生長速率，且有濃度依賴性;法舒地爾通過抑制RhoA/ROCK-1通

16、路，進(jìn)而影響B(tài)ax/Bcl-2比值，從而抑制碘克沙醇對HUVEC造成的損傷，抑制HUVEC凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.碘克沙醇可通過RhoA/ROCK-1通路引起HUVEC損傷，且有濃度、時(shí)間依賴性，法舒地爾可以通過抑制RhoA/ROCK-1通路減弱碘克沙醇對HUVEC的損傷;
　　2.RhoA/ROCK-1異常表達(dá)會(huì)抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)HUVEC凋亡，法舒地爾可通過抑制RhoA/ROCK-1通路影響B(tài)ax/Bcl