SLXL1、SLX2和SXLR5C及線粒體在生殖細(xì)胞中的定位和功能研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分化過(guò)程,它是所有動(dòng)物有性繁殖所必需的。該過(guò)程主要包括三個(gè)階段:精原細(xì)胞的有絲分裂階段,精母細(xì)胞的減數(shù)分裂階段和圓形精子變態(tài)生成延長(zhǎng)型精子的階段。從分子水平上看,精子發(fā)生是一系列特定基因程序性表達(dá)和轉(zhuǎn)錄的過(guò)程。然而,迄今為止從分子水平上理解哺乳動(dòng)物精子的發(fā)生過(guò)程十分有限。Slx-Like1(Slxl1),Scp3-like,X-linked,2(Slx2)和X-linked,lymphocyte-regulate

2、dcomplex,5c(Xlr5c)是3個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因,有關(guān)它們的定位和功能目前還是空白。本文利用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、發(fā)育生物學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、RNA干涉技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等手段研究這3個(gè)基因或蛋白在組織中的定位和功能,特別是在精子發(fā)生和減數(shù)分裂過(guò)程中所起的作用。本研究不僅有助于揭示精子發(fā)生的機(jī)理和減數(shù)分裂的調(diào)控機(jī)制;還可以幫助我們深入了解雄性不育的發(fā)生機(jī)制,為不育癥的治療和避孕藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 線粒體所產(chǎn)生的AT

3、P是哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得能量的主要來(lái)源。目前,對(duì)線粒體的分布、結(jié)構(gòu)和功能的研究已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。然而,線粒體在水牛生殖細(xì)胞中的定位、分布和功能鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本文研究活性線粒體在水牛顆粒細(xì)胞、精子細(xì)胞、卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的凋亡、定位和位移變化趨勢(shì)。本研究不僅有助于揭示顆粒細(xì)胞凋亡和卵巢閉鎖的關(guān)系,還有助于進(jìn)一步揭示水牛卵子成熟的機(jī)制;同時(shí)本研究建立了一種評(píng)價(jià)卵子發(fā)育潛能和胚胎發(fā)育潛能的評(píng)價(jià)指標(biāo),這有助于提高水牛卵母細(xì)胞體

4、外成熟的效率和早期胚胎移植的效率,也可為人類(lèi)輔助生育技術(shù)的發(fā)展開(kāi)辟新的研究思路。
　　 具體研究?jī)?nèi)容分為如下五個(gè)部分:
　　 研究一,小鼠睪丸新基因Slxl1的克隆、表達(dá)和功能鑒定,該基因所編碼的蛋白參與精子頂體的形成和精子受精的進(jìn)程。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)在mRNA水平上,利用RT-PCR檢測(cè)不同組織和不同階段的睪丸發(fā)現(xiàn),Slxl1mRNA在小鼠睪丸中特異性表達(dá);(2)利用抗原設(shè)計(jì)、融合蛋白原核表達(dá)和抗體

5、純化制備技術(shù)獲得了針對(duì)SLXL1蛋白的特異性多克隆抗體;(3)在蛋白水平上,利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)不同組織和不同階段的睪丸發(fā)現(xiàn),Slxl1編碼一個(gè)18kDa的蛋白并特異性的表達(dá)于睪丸組織中;(4)通過(guò)制備的多克隆抗體進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該蛋白定位在圓形精子、延長(zhǎng)型精子、附睪精子和成熟精子的頂體上;進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn),該蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與精子頂體的形成趨勢(shì)一致,上述結(jié)果表明該蛋白參與了精子頂體的形成;(5)通過(guò)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn),該蛋白與精子的頂

6、體蛋白DKKL1有相互作用并一起共定位在精子的項(xiàng)體上;(6)體外受精試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),應(yīng)用制備的兔源多克隆抗體可封閉該蛋白并導(dǎo)致體外受精率嚴(yán)重下降,而對(duì)照組的受精率沒(méi)有顯著變化。上述結(jié)果表明Slxl1是一個(gè)睪丸特異性表達(dá)蛋白,也是一個(gè)精子頂體相關(guān)蛋白。該蛋白不但參與了精子項(xiàng)體的形成過(guò)程而且還參與了精子和卵子的受精過(guò)程。
　　 研究二,小鼠Slx2基因的克隆、表達(dá)和功能鑒定,該基因所編碼的蛋白參與了減數(shù)分裂過(guò)程中聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成、同源染色

7、體重組、DNA斷裂修復(fù)和性染色體的失活等過(guò)程。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)在mRNA水平上,利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同組織和不同階段的睪丸和卵巢發(fā)現(xiàn),Slx2mRNA只在小鼠睪丸和卵巢中特異性表達(dá);(2)利用抗原設(shè)計(jì)、原核表達(dá)和抗體制備技術(shù)獲得了針對(duì)SLX2蛋白的特異性多克隆抗體;(3)在蛋白水平上,利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)不同組織和不同階段的睪丸和卵巢發(fā)現(xiàn),Slx2編碼的蛋白特異性的表達(dá)于出生后的睪丸組織和出生前的卵巢組織中;(

8、4)通過(guò)制備的多克隆抗體進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白與磷酸化組蛋白H2AX一起共定位在第一次減數(shù)分裂期的XY小體上。SLX2的表達(dá)趨勢(shì)與γH2AX的表達(dá)相似,而γH2AX是一個(gè)在減數(shù)分裂期特異性表達(dá)的蛋白,該蛋白與DNA損傷修復(fù)和性染色體的失活相關(guān),該結(jié)果表明SLX2參與了XY小體的形成、DNA損傷修復(fù)和性染色體的失活;(5)利用酵母雙雜交和免疫共沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SLX2與減數(shù)分裂復(fù)合體重要組成蛋白SYCE2和乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT5/TIP60

9、有相互作用,同時(shí)γH2AX蛋白和KAT5/TIP60蛋白相互作用一起參與了同源染色體重組和DNA斷裂修復(fù)。上述結(jié)果表明SLX2蛋白與SYCE2蛋白參與了聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成、同源重組和染色體斷裂修復(fù);上述結(jié)果還表明SLX2、SYCE2、KAT5/TIP60和γH2AX蛋白一起參與了減數(shù)分裂過(guò)程中的聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成、同源染色體重組、DNA斷裂修復(fù)和性染色體的失活等過(guò)程。
　　 研究三,一個(gè)小鼠新基因Xlr5c的克隆、表達(dá)和鑒定,該基因

10、所編碼的蛋白參與初級(jí)精母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂的過(guò)程。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)在mRNA水平上,利用RT-PCR檢測(cè)不同組織和不同階段的睪丸發(fā)現(xiàn)Xlr5cmRNA只在小鼠睪丸和卵巢中特異性表達(dá);(2)利用蛋白抗原設(shè)計(jì)、原核表達(dá)和抗體制備技術(shù)獲得了針對(duì)XLR5C蛋白的多克隆抗體;(3)在蛋白水平上,利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)不同組織和不同階段的睪丸發(fā)現(xiàn),Xlr5c編碼的蛋白特異性的表達(dá)于睪丸和卵巢組織中;它的表達(dá)明顯發(fā)生在精子減數(shù)分裂的

11、時(shí)間段中,該結(jié)果表明Xlr5c是一個(gè)時(shí)間相關(guān)性的基因,主要出現(xiàn)在精子發(fā)生的早期;(4)通過(guò)制備的多克隆抗體進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該蛋白定位在睪丸的生精細(xì)胞中,主要出現(xiàn)在發(fā)生減數(shù)分裂的精母細(xì)胞細(xì)胞核中。該結(jié)果顯示該基因所編碼的蛋白參與了精母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程;此外,在雌性卵泡的細(xì)胞質(zhì)中也檢測(cè)到它的表達(dá)。上述結(jié)果表明,該蛋白可能還參與精母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程,可能在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中也有一定的功能。
　　 研究四,熒光原位雜交分析研究

12、X染色體在生殖細(xì)胞中的定位,該定位可以作為牛(水牛)分離精子純度鑒定和早期胚胎性別鑒定的一種客觀鑒定手段。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)利用顯微切割技術(shù)和PCR技術(shù)制備了具有檢測(cè)有效性的牛X染色體熒光原位雜交探針;該探針可以特異性的與牛中期染色體的X染色體雜交;(2)熒光原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牛X染色體探針能檢測(cè)牛和水牛正常和分離精子的比率及早期胚胎卵裂球的性別。上述試驗(yàn)結(jié)果表明牛X染色體熒光原位雜交探針可以作為一種十分有效的方法用于牛

13、和水牛分離精子比率的鑒定和早期胚胎性別的鑒定。
　　 研究五,分析和研究活性線粒體在水牛卵巢顆粒細(xì)胞、精子細(xì)胞、體外培養(yǎng)成熟前后的卵母細(xì)胞以及早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的凋亡、分布和變化。
　　 研究結(jié)果顯示:(1)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)源于中型(3～6mm)卵泡的卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率明顯低于來(lái)源于大型卵泡(＞6mm)和小型卵泡(＜3mm)的顆粒細(xì)胞的凋亡率;(2)精子的活性線粒體主要定位在精子的尾部中段,這表明水牛精子尾部的運(yùn)動(dòng)所消耗

14、的能量主要來(lái)源于其線粒體所產(chǎn)生的ATP;(3)在體外培養(yǎng)成熟前后的卵母細(xì)胞中檢測(cè)發(fā)現(xiàn),活性線粒體的分布變化趨勢(shì)主要是從卵子的周邊逐漸向卵子的中心和染色體部位聚集;(4)在體外受精的合子細(xì)胞中,活性線粒體主要聚集在兩個(gè)原核的周邊;(5)活性線粒體在體外培養(yǎng)的不同時(shí)期的植入前胚胎中發(fā)生明顯的位移變化。總之,水牛卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率與卵泡的大小有關(guān);活性線粒體在水牛卵母細(xì)胞的體外成熟、受精和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)生顯著的位移變化,這表明線粒體可