Alport綜合征和SIOD患者的基因診斷及產(chǎn)前診斷研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 Alport綜合征的分子遺傳學(xué)
　　背景:Alport綜合征(Alport syndrome，AS)是一種臨床上以反復(fù)鏡下或肉眼血尿，慢性腎功能不全為主的進(jìn)行性遺傳性腎炎，常伴有眼部病變和高頻神經(jīng)性耳聾。Ⅳ膠原α3（COL4A3）、α4(COL4A4)、α5(COL4A5)基因突變是導(dǎo)致Alport綜合征病發(fā)的主要原因。本病的遺傳方式主要分為常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳和X

2、-連鎖顯性遺傳。其中由Ⅳ膠原α5突變導(dǎo)致的X-連鎖顯性遺傳是AS的主要遺傳方式，約占AS的85％。由于AS的致病基因COL4A3、COL4A4、COL4A5分別包含52、48和53個(gè)外顯子，且基因變異橫跨這三種膠原基因，故目前尚未發(fā)現(xiàn)存在突變熱點(diǎn)。AS是一種具有臨床異質(zhì)性的基底膜腎病，臨床診斷上有時(shí)易與薄基底膜腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化等腎臟疾病相混淆，造成誤診或漏診。目前第二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為AS的基因診斷奠定了基礎(chǔ)，使得快速高

3、效的對(duì)AS致病基因的定位和突變類(lèi)型的篩查成為可能。
　　方法:本文收集了6個(gè)疑似或確診的AS的家系，利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)AS的致病基因COL4A3、COL4A4、COL4A5進(jìn)行突變篩查，通過(guò)PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序技術(shù)在家系中行突變位點(diǎn)的驗(yàn)證。對(duì)突變位點(diǎn)行序列同源性的比對(duì)，觀察位點(diǎn)在進(jìn)化上的保守性。同時(shí)采用生物信息學(xué)的方法對(duì)突變是否具有致病性進(jìn)行分析。對(duì)于錯(cuò)義突變采用SIFT和Polyphen-2進(jìn)行有害性分析，采用Ma

4、xEntScan觀察剪切突變是否影響RNA的剪切。對(duì)200名正常對(duì)照行突變位點(diǎn)的測(cè)序，來(lái)排除突變位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)的可能性。
　　結(jié)果:通過(guò)全外顯子組測(cè)序共檢測(cè)出5個(gè)新的突變和2個(gè)已知的致病突變，其中包括2個(gè)新的c.4348C＞T(p.R1450X)、c.352G＞A(p.G118R)COL4A3突變，2個(gè)COL4A5新的突變c.3455-2A＞G、c.3817G＞A(p.G1273S)和2個(gè)已知的致病突變c.796C＞T(p.R2

5、66X)、c.2858G＞T(p.G953V)，1個(gè)COL4A4的新的突變c.1099G＞A(p.G367S)。這些突變?cè)贏S家系中測(cè)序發(fā)現(xiàn)與疾病均呈共分離。同源性比對(duì)結(jié)果顯示突變位點(diǎn)在進(jìn)化上也是高度保守的。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)突變的致病性分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是錯(cuò)義突變還是剪切突變對(duì)AS均是有害突變，一旦突變將影響基因的功能。
　　結(jié)論:本研究共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)新的AS的致病基因進(jìn)一步豐富了突變數(shù)據(jù)庫(kù)，為疑似的AS從致病基因?qū)用孢M(jìn)行了確診，避免了

6、誤診或漏診。進(jìn)一步揭示了基因診斷對(duì)臨床的具有重要意義，而致病基因的發(fā)現(xiàn)將為患者提供合理的預(yù)后治療，并為家族成員的遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。
　　第二部分 SIOD的分子遺傳學(xué)研究
　　背景:Schimke免疫骨發(fā)育不良(Schimke immunoosseous dysplasia，SIOD)是一種臨床以脊柱骨骺發(fā)育不良(spondyloepiphyseal dysplasia，SED)，身材矮小，T細(xì)胞缺乏，進(jìn)行性腎病綜

7、合征和特殊面容為主要特征的罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病。本病的發(fā)病率約為1∶(100萬(wàn)～300萬(wàn))。而SMARCAL1是目前SIOD唯一已知的致病基因，約有50％的患者無(wú)法檢測(cè)到其致病突變。SIOD是一種具有臨床異質(zhì)性的累及多個(gè)系統(tǒng)的疾病，臨床表現(xiàn)往往從輕度表型到嚴(yán)重表型不等。SMARCAL1基因突變中往往無(wú)義突變和錯(cuò)義突變居多，而錯(cuò)義突變易引起SIOD輕度的臨床表型，而無(wú)義突變及與其他類(lèi)型的組合突變都易造成嚴(yán)重的SIOD表型的出現(xiàn)。目前與

8、國(guó)外研究相比，國(guó)內(nèi)關(guān)于SIOD的研究還知之甚少。
　　方法:本研究收集到一例臨床表型疑似SIOD的患者，利用PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序技術(shù)對(duì)致病基因SMARCAL1基因行突變研究。然后對(duì)突變位點(diǎn)行序列同源性的比對(duì)，觀察位點(diǎn)在進(jìn)化上的保守性。同時(shí)采用生物信息學(xué)的方法對(duì)突變是否具有致病性進(jìn)行分析。對(duì)于錯(cuò)義突變采用SIFT和Polyphen-2進(jìn)行有害性分析，采用MaxEntScan觀察剪切突變是否影響RNA的剪切。對(duì)200名正常對(duì)照

9、行突變位點(diǎn)的測(cè)序，來(lái)排除突變位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)的可能性。
　　結(jié)果:通過(guò)直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SMARCAL1基因的突變c.1933C＞T，(p.R645C)和c.2450G＞A (p.R817H)。R645C突變來(lái)自臨床表型正常的母親，為已知的致病基因;而R817H為新的突變來(lái)源于臨床表型正常的父親。同源性比對(duì)結(jié)果顯示這兩個(gè)突變位點(diǎn)在進(jìn)化上也是高度保守的。生物信息學(xué)對(duì)突變的致病性分析發(fā)現(xiàn)，R817H的錯(cuò)義突變SIFT軟件的預(yù)測(cè)值為0和

10、Polyphen-2軟件預(yù)測(cè)值為1，此兩個(gè)的值都說(shuō)明突變對(duì)SMARCAL1基因功能的正常發(fā)揮是有害的。
　　結(jié)論:本研究共發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的復(fù)合的SMARCAL1基因突變導(dǎo)致SIOD的發(fā)生，進(jìn)一步豐富了SMARCAL1基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)研究中的疑似SIOD患者從致病基因?qū)用孢M(jìn)行了確診，避免了誤診或漏診。進(jìn)一步揭示了基因診斷對(duì)臨床的具有重要意義，而致病基因的發(fā)現(xiàn)將為患者提供合理的預(yù)后治療，并為家族成員的遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

11、r>　　第三部分 Alport綜合征三家系的產(chǎn)前基因診斷
　　背景:Alport綜合征臨床表現(xiàn)最突出的是血尿，但是隨著年齡的增長(zhǎng)可出現(xiàn)少量蛋白尿甚至大量蛋白尿，并且最終逐漸進(jìn)展為腎功能衰竭從而需要進(jìn)行透析甚至腎臟的移植。然而目前Alport綜合征尚無(wú)有效的根治辦法且預(yù)后差，AS的產(chǎn)前診斷可以有效的避免患兒的再次出生以減輕家庭及國(guó)家的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。因此對(duì)于孕期的前期診斷尤其是產(chǎn)前基因診斷顯得尤為重要。
　　方法:收集AS三家

12、系先證者及其父母的外周血，并分別采集先證者孕期為18周、20周和20周的母親的羊水10ml。采用STR技術(shù)來(lái)排除母體細(xì)胞的污染，然后行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行DNA測(cè)序。
　　結(jié)果:結(jié)果顯示三家系的母體細(xì)胞均無(wú)污染，經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)家系Ⅰ的先證者母親羊水檢測(cè)尚未發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶同先證者相同的COL4A5基因c.1909C＞T (p.637Q＞X)的雜合無(wú)義突變，可以正常分娩;而家系Ⅱ的先證者母親羊水檢測(cè)顯示胎兒攜帶有COL4A5基因