Paraconiothyriumvariabile GHJ-4漆酶的發(fā)酵、分離純化及其酶學性質(zhì)的研究.pdf

1、漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，具有廣泛的底物，不僅能催化氧化多種芳香族化合物，還能降解木質(zhì)素、去除許多有毒酚類物質(zhì)如苯氧基類除草劑等的毒性，還可以使多種染料脫色及去除石油工業(yè)廢水的毒性；因此在造紙、環(huán)保、食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物檢測等領(lǐng)域具有較大的研究和應(yīng)用價值。鑒于此，以本實驗室篩選到的一株高產(chǎn)漆酶菌株P(guān)araconiothyrium variabile GHJ-4(簡稱：GHJ-4）為研究對象。<

2、br>　　 采用統(tǒng)計學方法對GHJ-4菌株產(chǎn)漆酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，并進一步對菌株GHJ-4 所產(chǎn)漆酶進行了分離純化及其酶學性質(zhì)的研究，主要內(nèi)容如下：
　　 1.通過搖瓶培養(yǎng)，結(jié)合統(tǒng)計分析方法研究了發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對GHJ-4 產(chǎn)漆酶活性的影響。
　　 通過單次因子試驗和正交試驗確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源、氮源、碳氮比、無機鹽。在此基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，首先采用Plackett-B

3、urman（PB）
　　 試驗設(shè)計篩選出了影響該菌產(chǎn)漆酶的三個重要因素：可溶性淀粉、牛肉浸膏和CuSO4；
　　 繼而采用最陡爬坡試驗逼近最大響應(yīng)區(qū)域，并結(jié)合中心組合試驗以及響應(yīng)面分析，建立了以漆酶酶活為響應(yīng)值的二次回歸方程模型，從中獲得了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：麩皮30g/L，可溶性淀粉58.08 g/L，牛肉浸膏3.39 g/L，NaNO3 1 g/L，KH2PO4 3G/L，CuSO4 0.554g/L。
　　

4、在優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，結(jié)合統(tǒng)計分析方法對發(fā)酵條件經(jīng)了優(yōu)化，首先用PB法篩選出四個影響較大的因素，即接種量、培養(yǎng)時間、裝樣量和轉(zhuǎn)速；繼而采用最陡爬坡試驗逼近最大響應(yīng)區(qū)域，并結(jié)合中心組合試驗以及響應(yīng)面分析，建立了以漆酶酶活為響應(yīng)值的二次回歸方程模型，從中獲得了最佳發(fā)酵條件為：接種量6.43％（v/v），溫度28℃，初始pH4，培養(yǎng)時間182 h，裝液量72.5 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速157 r/min，種齡96 h。
　　

5、采用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，供試菌株的漆酶酶活達到710.44 U/mL，較優(yōu)化前漆酶的產(chǎn)量提高了16.4倍，其試驗值與預(yù)測值基本相符，說明預(yù)測模型可靠性高，可應(yīng)用于漆酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。
　　 2.GHJ-4 漆酶的分離純化及其酶學性質(zhì)菌株GHJ-4 液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的漆酶通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-sepharose Fast Flow陰離子交換樹脂、SephadeXG-75分子篩柱層析三步分離純化后，得到電泳純的漆酶，純化倍