擴(kuò)展青霉TS414脂肪酶在畢赤酵母的表達(dá)、純化及其催化外消旋萘普生酯化拆分的研究.pdf

1、本論文以擴(kuò)展青霉TS414脂肪酶在畢赤酵母X-33的表達(dá)、純化和重組擴(kuò)展青霉TS414脂肪酶在有機(jī)相中催化外消旋萘普生酯化拆分為主線,開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的研究:
　　 首先,優(yōu)化了X33-TS414-lip工程菌的搖瓶發(fā)酵條件:pH為7.5、接種量為20D、甲醇濃度為0.75％、搖瓶裝量為10％、轉(zhuǎn)速為250rpm、溫度為30℃。進(jìn)一步在搖瓶?jī)?yōu)化的基礎(chǔ)上考察三種不同的甲醇流加策略對(duì)該菌進(jìn)行罐上產(chǎn)脂肪酶的影響。溶氧控制策略的酶活為

2、104U/ml,酶產(chǎn)率為962U/l·h；變色酸法維持低濃度甲醇策略的酶活為443U/ml,酶產(chǎn)率為4614.58 U/l·h;甘油甲醇混合誘導(dǎo)過(guò)渡策略的酶活為573U/ml,產(chǎn)率為6821.43U/l·h,經(jīng)優(yōu)化后發(fā)酵策略的酶產(chǎn)率為溶氧控制策略的5.51倍。
　　 其次,重組擴(kuò)展TS414脂肪酶發(fā)酵液經(jīng)過(guò)飽和硫酸銨沉淀、Sephacryl S-100凝膠過(guò)濾層析、Phenyl Sepharose疏水層析三個(gè)純化步驟后達(dá)到電泳純

3、,酶液的比酶活力由最初2988.03 U/mg提高至7909.74U/mg,提高了2.65倍,活性回收率為39.69％。重組TS414脂肪酶對(duì)外消旋萘普生的拆分效果與野生型脂肪酶相近。
　　 最后,確立固定化重組擴(kuò)展青霉TS414脂肪酶酯化拆分萘普生的最佳反應(yīng)條件:一、固定化條件:天津光復(fù)AB-8大孔吸附樹(shù)脂、樹(shù)脂與酶質(zhì)量比為1:8、pH值為9.0、固定化吸附時(shí)間1.5h、凍干1 h；二、酯化拆分體系:固定化酶量為0.06g、外