釀酒酵母線粒體NAD激酶對(duì)生物氧化功能的作用.pdf

1、NADPH是生物體的一種重要輔酶，它不僅在生物合成反應(yīng)中負(fù)責(zé)提供還原力，而且對(duì)于細(xì)胞抵抗活性氧的毒害也有重要作用。釀酒酵母POS5基因編碼了線粒體NAD激酶，負(fù)責(zé)線粒體NADPH的從頭合成。Pos5p作為線粒體NADPH的重要供應(yīng)者，對(duì)于線粒體一些功能的維持起到重要作用。除了Pos5p以外，線粒體中一些NADP+-依賴性脫氫酶，如由IDP1基因編碼的NADP+-依賴性異檸檬酸脫氫酶，通過使NADP+還原成NADPH，也能夠提供NADPH

2、。
　　 為了進(jìn)一步研究釀酒酵母線粒體NADPH的優(yōu)勢供應(yīng)途徑，我們構(gòu)建了pos5idpl△和pos5zwfl△雙缺失體。針對(duì)pos5△、idpl△、pos5idpl△、以及其他一些關(guān)鍵基因與POS5基因的雙缺失體，通過表型研究，包括生長性能、溫度敏感性、對(duì)非發(fā)酵性碳源的利用能力、對(duì)精氨酸和甲硫氨酸的合成能力等，初步解析釀酒酵母線粒體中NADPH的主要供應(yīng)途徑及NAD激酶在線粒體中的功能。結(jié)果表明:Pos5p是釀酒酵母線粒體NA

3、DPH的主要供應(yīng)者，POS5基因的缺失會(huì)造成菌體多方面生長性能的改變，Idplp對(duì)線粒體NADPH的貢獻(xiàn)不如Pos5p。
　　 由于POS5突變株表現(xiàn)出對(duì)非發(fā)酵性碳源的利用缺陷，說明敲除POS5基因會(huì)導(dǎo)致釀酒酵母細(xì)胞產(chǎn)生呼吸障礙，于是測定了野生株BY4742和突變株pos5A、idpl△、pos5idpl△的呼吸鏈各復(fù)合物活性。通過對(duì)比BY4742和各突變株在不同培養(yǎng)基(YPD和SD培養(yǎng)基)和不同生長階段下(對(duì)數(shù)中期和對(duì)數(shù)末期)

4、呼吸鏈復(fù)合物II(琥珀酸脫氫酶復(fù)合體；EC1.3.5.1)、復(fù)合物Ⅲ(細(xì)胞色素c還原酶復(fù)合體；EC1.10.2.2)、復(fù)合物IV(細(xì)胞色素c氧化酶復(fù)合體；EC1.9.3.1)以及復(fù)合物II+Ⅲ的活性，發(fā)現(xiàn)突變株的復(fù)合物活性均比野生株低，而雙突變株的活性更低，說明POS5基因缺失引起的呼吸障礙表型確實(shí)是與呼吸鏈各復(fù)合物在分子水平上的活性降低有關(guān)。
　　 線粒體NADPH的主要供應(yīng)者Pos5p可以使NAD(H)向NADP(H)轉(zhuǎn)變，

5、細(xì)胞質(zhì)NADPH的主要供應(yīng)者Zwflp可以使NADP+向NADPH轉(zhuǎn)變，對(duì)不同形式的輔酶的轉(zhuǎn)變是它們行駛特定功能及產(chǎn)生特定表型的重要原因。為了了解它們是否以及如何影響細(xì)胞內(nèi)NAD(P)類輔酶的形式及含量，我們利用HPLC法，對(duì)比分析了野生株和突變株胞漿內(nèi)NAD+、NADH、NADP+和NADPH的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)idpl△、pos5△、pos5idpl△與野生株BY4742和回補(bǔ)體pos5△/POS5-YEp相比，胞內(nèi)NADP+和NADP