金屬硫蛋白抗阿霉素心臟毒性作用的基因組學與蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、阿霉素(Doxorubicin，DOX)屬葸醌類化合物，是臨床上常用的廣譜、高效抗腫瘤藥物，廣泛用于急慢性白血病及各種實體瘤的治療。然而，DOX具有明顯的心臟毒性，嚴重限制了其臨床應用。因此，探討DOX所致心臟毒性的機制，尋找有效的防護措施和拮抗藥物，具有重要的理論意義和應用價值。金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類富含還原型半胱氨酸殘基的低分子量非酶蛋白，廣泛存在于哺乳動物的各種器官和組織中，參與體內(nèi)許多生理及病理

2、過程。有報道表明，MT能拮抗電離輻射、炎癥、感染、藥物毒副作用等因素所致的損傷，在氧化應激狀態(tài)下對機體組織細胞具有保護作用，是一種內(nèi)源性的細胞保護物質(zhì)，但其保護作用機制仍不十分清楚。機體內(nèi)MT主要與Zn<'2+>、Cd<'2+>、Cu<'2+>等二價金屬離子絡合，能廣泛地被重金屬、炎癥、休克、饑餓、電離輻射、抗癌藥物等因素誘導表達。其中鋅(Zn)屬高效而且安全的MT誘導劑，較低劑量的Zn即可有效誘導MT的表達。近年來，應用基因敲除技術(shù)建

3、立的MT基因缺失小鼠動物模型為研究生物體內(nèi)MT的生物學功能及其作用機制提供了有力工具。 本課題利用MT-Ⅰ/Ⅱ基因敲除型小鼠(MT-/-)和野生型小鼠(MT+/+)，通過Zn預處理的方式，建立MT的三種表達水平模型(即缺失一生理表達量一高表達)，觀察MT不同表達水平對DOX所致心臟毒性損傷的影響，探討MT是否對DOX心臟毒性損傷具有保護作用以及可能的作用機制。在傳統(tǒng)毒性機制研究的基礎上，本研究聯(lián)合基因組學技術(shù)和蛋白組學技術(shù)，從整

4、體水平上分析DOX給藥后MT+/+小鼠與MT-/-小鼠心臟組織相關基因/蛋白質(zhì)的變化情況，從基因網(wǎng)絡調(diào)控的角度探討MT拮抗DOX心臟毒性損傷的可能作用機制，并試圖尋找在MT發(fā)揮對DOX心臟毒性拮抗作用中可能起重要作用的關鍵蛋白，為臨床上合理使用DOX以及開發(fā)DOX心臟毒性保護劑提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)DOX(15 mg/kg，i．p．)能引起MT+/+小鼠及MT-/-小鼠心臟明顯的毒性損傷，表現(xiàn)為血漿CK及LDH活性升高、cTnT含量增加

5、、心肌組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理學改變、心臟組織脂質(zhì)過氧化，且這些毒性表現(xiàn)在MT-/-小鼠比MT+/+小鼠更為嚴重。連續(xù)2天給予Zn預處理(300μmol/kg，s．c．，每天一次)能顯著提高MT+/+小鼠心臟組織中MT水平(相當于對照組的25倍)，且Zn預處理誘導的MT高表達明顯抑制了DOX引起的MT+/+小鼠心臟毒性損傷。MT-/-小鼠經(jīng)Zn預處理后未見其心臟組織中MT水平有明顯改變，對DOX誘發(fā)的心臟毒性損傷無拮抗作用。以上結(jié)果提示，MT對

6、DOX心臟毒性損傷具有保護效應，且在此保護效應中發(fā)揮關鍵作用的可能是MT，而不是Zn本身。本研究還發(fā)現(xiàn)，DOX給藥后心臟組織O<,2>含量升高且3-NT呈彌漫性強陽性信號，而Zn誘導的MT高表達則可抑制DOX引起的O<,2>生成的增加和3-NT的表達增高；提示由O<,2>生成增加導致的ONOO<'->水平升高可能參與了DOX心臟毒性作用過程，而MT對心臟的保護作用的機制之一可能是MT對ONOO<'->生成的抑制作用，從而減少了ONOO<

7、'->引發(fā)的心肌細胞毒性損傷。即MT可能是通過其清除自由基的功能從而發(fā)揮對DOX心臟毒性的拮抗作用。 利用小鼠全基因組表達譜芯片GeneChip Mouse Genome 430 2.0對MT+/+小鼠和MT-/-小鼠給予DOX后心臟全基因組表達譜的改變進行研究的結(jié)果表明：①生理狀態(tài)下，MT-/-小鼠心臟組織與MT+/+小鼠相比有10個差異表達基因(fold change>2或<0．5)，這些基因可能對細胞因子與細胞因子受體相互

8、作用以及Jak-STAT生物學通路有影響，提示正常狀態(tài)下兩種小鼠對外界刺激的應激能力可能就有差異，因而導致對應激損傷的反應不同。②DOX給藥后MT-/-小鼠與MT+/+小鼠心臟組織差異表達基因為50個，其中有8個編碼細胞膜組分，7個編碼線粒體組分，3個編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分，提示細胞質(zhì)膜、線粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷可能是MT發(fā)揮心臟保護效應的調(diào)控環(huán)節(jié)。50個差異表達基因中包括解偶聯(lián)蛋白3(ucp3)，鈣網(wǎng)蛋白3(calr3)，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)

9、移酶l家族(ugt1)，peroxiredoxin 2 (prdx2)等，提示拮抗自由基引起的氧化應激、糾正鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、以及減弱機體對毒物的代謝活化等可能是MT發(fā)揮對DOX心臟毒性拮抗作用的調(diào)控環(huán)節(jié)。③將MT-/-小鼠與MT+/+小鼠在給予DOX前后的差異表達基因進行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有483個基因的變化趨勢不同；其GO分子功能的類別主要集中于蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合(尤其是鋅離子結(jié)合與鈣離子結(jié)合)、DNA結(jié)合、受體活性、激酶活性、ATP

10、結(jié)合、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性以及轉(zhuǎn)錄因子活性等。其相關的生物學通路包括有關氨基酸代謝、核苷酸代謝、糖代謝、脂肪酸代謝、氧化磷酸化、谷胱甘肽代謝、細胞色素P450對外來化合物的代謝等，提示這些基因及生物學通路可能與MT發(fā)揮對DOX心臟毒性的拮抗效應有關。 利用雙向凝膠電泳技術(shù)蛋白質(zhì)組學對MT+/+小鼠與MT-/-小鼠給予DOX后心臟組織總蛋白的改變進行研究，共鑒定出13個差異表達蛋白，分別是乙酰輔酶A脫氫酶短鏈和中鏈、異戊酰輔酶A

11、脫氫酶、Peroxiredoxin家族3和6、抑制素、α-B晶狀體球蛋白、ATP合成酶、泛醇-細胞色素C還原酶核心蛋白1、肌球蛋白輕鏈4、磷酸丙糖異構(gòu)酶1、烯醇酶3以及ES1蛋白。其功能主要集中在脂肪酸代謝、糖酵解和糖異生、電子傳遞呼吸鏈、細胞抗氧化防御系統(tǒng)以及心肌結(jié)構(gòu)蛋白。采用’Western blot對典型的差異蛋白——抑制素的表達量進行驗證，結(jié)果顯示與蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果的相關系數(shù)達到0.991。13個差異表達蛋白中，Peroxir