副溶血弧菌轉(zhuǎn)錄因子AphA調(diào)控生物膜基因的初步研究.pdf

1、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡稱VP）是一種嗜鹽性革蘭氏陰性致病菌，人們?nèi)羰秤昧吮籚P菌污染的生的或未煮熟的食物后可能會引起發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等急性胃腸炎癥狀。VP菌可以游離于海水環(huán)境，也可以在固相表面形成生物膜，生物膜是其適應(yīng)不利環(huán)境而采取的主要生存策略，生物膜形成受環(huán)二鳥苷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)信號通路和密度感應(yīng)(Quorum sensing，QS)系統(tǒng)

2、的調(diào)節(jié)。VP菌在小核糖核酸RNA(Quorum-regulated small RNAs，QrrsRNAs)的參與下，調(diào)節(jié)全局調(diào)控子OpaR和AphA的表達(dá)。VP菌在高密度時(shí)，OpaR起核心調(diào)節(jié)作用;在低密度時(shí)，AphA起核心調(diào)節(jié)作用，通過表型結(jié)果顯示它能促進(jìn)生物膜形成和毒力因子的表達(dá)，但是其分子機(jī)制還未被闡明。
　　目的:綜合運(yùn)用表型與分子生化實(shí)驗(yàn)研究AphA蛋白對VP菌生物膜形成的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:首先利用菌落褶皺與

3、結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)比較野生株(WT)和aphA突變株（△aphA）的表型差異;進(jìn)而再利用色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)的方法檢測WT與△aphA各自中c-di-GMP分子的含量。
　　利用生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)AphA蛋白位于胞漿區(qū)的N-末端DNA結(jié)合域的上下游引物，擴(kuò)增AphA蛋白N-末端DNA結(jié)合域，然后酶切連接到pET-28a-c(+)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(λDE3)中，通過鑒定篩選出AphA的蛋白表達(dá)株，所得菌株經(jīng)IPT

4、G誘導(dǎo)后，再經(jīng)Ni-NTA柱純化，最后透析濃縮得到帶His標(biāo)簽的AphA蛋白。
　　利用生物信息學(xué)的方法，對AphA蛋白與DNA的結(jié)合基序進(jìn)行預(yù)測，并篩選感興趣的基因，通過凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)（Electrophoretic mobilityshift assay，EMSA）驗(yàn)證His-AphA蛋白對生物膜靶基因啟動子區(qū)是否具有直接的相互作用。
　　利用生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)9個生物膜基因（包括胞外多糖和c-di-GMP合成的基因）的啟

5、動子區(qū)上下游引物，擴(kuò)增這些毒力基因啟動子區(qū)，然后酶切連接到pHRP309質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，鑒定、測序并篩選出陽性的單克隆，提取重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到副溶血弧菌野生株(WT)和aphA突變株（△aphA）中，通過測定野生株(WT)和突變株（△aphA）中β-半乳糖苷酶活性的差異，研究AphA對靶基因的調(diào)控關(guān)系。
　　提取WT和△aphA的總RNA，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法研究AphA對scrABC和scrG的調(diào)控關(guān)

6、系;
　　結(jié)果:通過表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AphA能促進(jìn)VP菌生物膜的形成，利用色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測WT與△aphA各自中c-di-GMP分子的含量，結(jié)果顯示AphA能促進(jìn)c-di-GMP的合成;利用大腸桿菌BL21(λDE3)表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出了有活性的His-AphA蛋白。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:His-AphA蛋白能特異性地結(jié)合到VP0376、VP0485和VP1469的啟動子區(qū)，VPA1513(scrABC)、VP1377(sc

7、rG)、VP0117、VPA0198、VP1403和VP1476的啟動子區(qū)無直接結(jié)合作用;LacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AphA能激活VP1469和VP0485的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而對VPA1513、VP1377和VP0376具有轉(zhuǎn)錄抑制作用;利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法研究表明AphA抑制scrABC和scrG的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　結(jié)論:所表達(dá)的His-AphA蛋白可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究;AphA通過直接激活VP0485、VP14