DDAH2基因修飾EPC加速裸大鼠球囊損傷后再內(nèi)皮化進程的研究.pdf

1、研究背景:冠心病患者內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)功能降低是影響支架植入后內(nèi)皮修復和導致再狹窄的重要原因。近期發(fā)現(xiàn)冠心病患者內(nèi)源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制物非對稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)增高與EPCs功能降低密切相關(guān)，二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylarginine dime

2、thylaminohydrolase，DDAH)是體內(nèi)代謝ADMA的關(guān)鍵酶，它在與動脈粥樣硬化有關(guān)的疾病中功能降低而導致ADMA增高，兩者的消長密切影響心血管系統(tǒng)的功能狀態(tài)。本項目擬構(gòu)建DDAH2基因過表達的EPCs，觀察DDAH2基因過表達對EPCs功能的影響。并在球囊損傷的裸大鼠模型上，進一步觀察移植DDAH2基因過表達的hEPCs對血管的再內(nèi)皮化及內(nèi)膜增生的影響。探討DDAH/ADMA系統(tǒng)與EPCs功能改變之間的關(guān)系。本研究將有助

3、于揭示EPCs功能損傷的機制，并為再狹窄的防治提供新的思路。
　　方法:實驗分為三個部分:
　　(1) EPCs分離與鑒定:采用密度梯度離心法分離人臍血的單個核細胞，培養(yǎng)至第10天，采用乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)與荊豆凝集素1(FITC-UEA-1)雙染鑒定，以及流式細胞儀檢測分子標志CD133，CD34和vWF以進一步鑒定是否為EPCs。
　　(2) DDAH2基因過表達對EPCs功能的影響:其中DDA

4、H基因過表達慢病毒載體構(gòu)建由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司協(xié)助完成;采用熒光法以及RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率。采用細胞計數(shù)法，檢測EPCs對人纖維粘接蛋白以及內(nèi)皮細胞的黏附功能。采用改良的Boyden小室，檢測EPCs的遷移能力。
　　(3) DDAH2基因過表達EPCs對裸大鼠球囊損傷后再內(nèi)皮化進程以及內(nèi)膜增生的影響。采用伊文思蘭染色檢測再內(nèi)皮化;采用HE染色檢測內(nèi)膜增生。
　　結(jié)果:
　　(1) DDAH2過表達EP

5、Cs對人纖維連接蛋白(FN)的黏附能力顯著增強，與對照組比較，P＜0.01，而轉(zhuǎn)染非目的基因的EPCs(NonT-EPCs)對人纖維連接蛋白的黏附作用無明顯增強;DDAH2過表達EPCs顯著增加TNF-α誘導的EPCs-內(nèi)皮細胞黏附，與對照組比較，P＜0.01，而轉(zhuǎn)染非目的基因的EPCs(Non T-EPCs)無類似作用。
　　(2)過表達DDAH2顯著增強了SDF-1誘導的EPCs遷移能力，與對照組比較，P＜0.01，而轉(zhuǎn)染非目

6、的基因的EPCs(Non T-EPCs)無類似作用。
　　(3)在球囊損傷后移植DDAH2過表達的EPCs顯著增加再內(nèi)皮化率，與對照組（局部注射PBS液）相比，P＜0.01。
　　(4)移植過表達DDAH2的EPCs后，可顯著抑制裸大鼠頸動脈球囊損傷后的內(nèi)膜增生，對照組（局部注射PBS液）相比，P＜0.01。
　　結(jié)論:(1)首次證實DDAH2過表達的EPCs黏附和遷移能力顯著增強;(2)成功構(gòu)建裸大鼠球囊損傷模型，并