microRNA-17抑制人包皮成纖維細(xì)胞衰老的作用及機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞衰老(cellular senescence)是細(xì)胞進(jìn)入一種周期不可逆轉(zhuǎn)的停滯而達(dá)到的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。細(xì)胞衰老主要受到p53-p21通路和p16-pRb通路的調(diào)控，當(dāng)這兩條通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子如p21蛋白表達(dá)下降或細(xì)胞周期蛋白cyclinD的蛋白表達(dá)上調(diào)時(shí)，細(xì)胞可以延緩衰老或繞過(guò)衰老程序繼續(xù)增殖。
　　miR-17家族，亦可稱(chēng)為miR-106b家族，是由6個(gè)序列相似，結(jié)構(gòu)相仿，種子區(qū)序列相同(AAAGUGCU)，物種間高度保守的

2、成熟體miRNA組成。 miR-17可以通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F家族和pRb蛋白水平的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)影響細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，提示miR-17在細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用。但是miR-17上游和下游的調(diào)控因子和機(jī)制還不十分明確。因此研究miR-17調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的作用與機(jī)制，對(duì)于研究和治療衰老相關(guān)疾病，探索腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)理有著重要意義。
　　研究目的:
　　1.人包皮成纖維細(xì)胞（human foreskin fibr

3、oblasts，HFF）體外分離培養(yǎng)、生長(zhǎng)與傳代并觀(guān)察各代HFF的增殖規(guī)律和特點(diǎn)。
　　2.研究miR-17對(duì)HFF細(xì)胞衰老的影響。
　　3.明確miR-17對(duì)HFF細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。
　　4.研究miR-17對(duì)HFF細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)控作用。
　　研究方法:
　　1.無(wú)菌取7歲患者的手術(shù)切除的包皮，利用DispaseⅡ酶消化的方法獲得較高純度的HFF，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3代HFF，用兔抗人波形蛋白(Vi

4、mentin)單克隆抗體作為一抗，采用免疫組織化學(xué)SABC法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　2.慢病毒感染HFF72h后，熒光倒置顯微鏡觀(guān)察HFF-miR-17及HFF-NC細(xì)胞中GFP的表達(dá)，并拍照。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)HFF-miR-17及HFF-NC中miR-17的表達(dá)情況。
　　3.通過(guò)CCK-8法觀(guān)察HFF-miR-17和HFF-NC生長(zhǎng)變化，并繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)HFF-miR-17和H

5、FF-NC細(xì)胞中衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的表達(dá)情況。
　　4.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HFF-miR-17與HFF-NC細(xì)胞周期的變化情況。利用Westem blotting檢測(cè)，空白對(duì)照細(xì)胞HFF、陰性對(duì)照細(xì)胞HFF-NC和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞HFF-miR-17中p21和cyclinD1蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.采用SABC法對(duì)細(xì)胞行免疫化學(xué)染色，實(shí)驗(yàn)組用兔抗人波形蛋白單克隆抗體作為一抗，顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形

6、或多角形，細(xì)胞胞漿呈棕色染色，提示其為HFF細(xì)胞。
　　2.慢病毒感染HFF72h后，熒光顯微鏡下檢測(cè)到綠色熒光分布于細(xì)胞內(nèi)，與光學(xué)顯微鏡下同一視野對(duì)比，熒光示感染效率達(dá)90％，提示感染成功。慢病毒感染HFF72h后，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)到感染了Lenti-miR-17的細(xì)胞與感染了Lenti-NC的細(xì)胞相比，miR-17表達(dá)明顯上調(diào)，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.通過(guò)CCK-8法觀(guān)察HFF細(xì)胞生長(zhǎng)

7、的變化。與陰性細(xì)胞HFF-NC相比，穩(wěn)定表達(dá)miR-17的HFF-miR-17細(xì)胞在450nm處的吸光度值連續(xù)六天均明顯升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明miR-17能夠促進(jìn)HFF細(xì)胞的增殖能力。
　　4.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色，HFF-miR-17細(xì)胞顯示出較弱的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色，不到1％的細(xì)胞被染成藍(lán)色，提示此時(shí)細(xì)胞為正常細(xì)胞;而對(duì)照細(xì)胞HFF-NC中有高達(dá)20％的細(xì)胞被染成藍(lán)色，表明細(xì)胞

8、已衰老，提示miR-17的表達(dá)顯著抑制了細(xì)胞的衰老。
　　5.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示HFF-miR-17細(xì)胞與對(duì)照HFF-NC相比，停滯在G1期的細(xì)胞明顯減少(81.5％ vs72.6％);用DNA破壞物質(zhì)Bleomycin處理細(xì)胞后，72.9％的HFF-NC細(xì)胞停滯在G1期，僅有2.5％的HFF-NC細(xì)胞能夠越過(guò)G1期進(jìn)入S期，而HFF-miR-17細(xì)胞停滯在G1期的比例顯著減少(54.6％)，進(jìn)入S期的增多(10

9、.2％)，說(shuō)明miR-17促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行增殖且能越過(guò)藥物誘導(dǎo)的G1 arrest。另外所有流式結(jié)果圖中均沒(méi)有出現(xiàn)凋亡峰，說(shuō)明miR-17不是通過(guò)抑制細(xì)胞的凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖的。
　　6.Westem blotting檢測(cè)顯示，與空白對(duì)照HFF細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞HFF-NC相比，p21蛋白表達(dá)水平在HFF-miR-17中下調(diào)，而cyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明miR-17能夠通過(guò)調(diào)控p21和cyclinD1蛋白表達(dá)水平

10、，促進(jìn)原代細(xì)胞的增殖，抑制原代細(xì)胞的衰老。
　　研究結(jié)論:
　　1.利用DispaseⅡ酶消化的方法能獲得較高純度的HFF，并首次用慢病毒感染系統(tǒng)成功構(gòu)建了在人包皮成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)miR-17的細(xì)胞系。
　　2.miR-17能夠抑制HFF細(xì)胞的衰老。
　　3.miR-17能夠促使HFF由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　4.miR-17能夠調(diào)控HFF中p21和cyclinD1蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)原代細(xì)