泡沫病毒轉錄激活因子調控宿主細胞周期并受宿主細胞microRNA的調控.pdf

1、病毒是一種病原體,由于自身包裝能力的限制,所以必須依賴于宿主細胞進行增殖與復制,并且對宿主細胞造成破壞。與此相反,宿主細胞在病毒進入到自身后,馬上會啟動其防御機制,抵抗、削弱、甚至清除病毒感染。本論文主要以泡沫病毒為研究工具,研究該類病毒對宿主細胞,特別是宿主細胞周期的抑制作用。以及宿主microRNA對病毒相關基因的調控及對病毒復制的影響。本研究還初步揭示了RNA沉默抑制因子,即番茄叢矮病毒的P19蛋白,對宿主細胞周期相關基因有顯著的

2、調控作用。
　　 Borf1蛋白是牛泡沫病毒編碼的轉錄激活因子,可影響其自身及病毒結構基因的表達。但目前對Borf1在宿主細胞周期上是否發(fā)揮作用還不清楚。在本研究中,我們通過構建人胚腎293穩(wěn)定表達Borf1的細胞系來研究其對宿主細胞的影響。研究發(fā)現(xiàn),在細胞內穩(wěn)定表達Borf1可顯著引發(fā)細胞在G1/G0的阻滯,并且降低S期細胞的比例。用半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),Borf1可在mRNA水平下調cyclin A2,cyclin B

3、1,cyclin E1和CDC2,及上調CDK2和E2F-1的表達。蛋白水平的分析進一步核實上述結果,并且發(fā)現(xiàn)Borf1還可抑制P15蛋白表達。因此,Borf1通過影響周期相關蛋白表達,在G2-M及G1-S限制位點上發(fā)揮作用,進而引發(fā)細胞G1期阻抑。
　　 番茄叢矮病毒的P19蛋白不僅是一個重要的病毒致病因子,而且還可作為RNA干擾(RNAi)的抑制因子。這種作用是通過限制細胞內的小RNA,比如小干擾RNA(siRNAs)和mi

4、croRNA(miRNAs)來實現(xiàn)。但是目前人們對P19蛋白是否可能對哺乳動物細胞產生不利影響還不知。在本研究中,我們構建了一株p19穩(wěn)定表達的293細胞系,即293-p19。流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)在293細胞中過量表達P19蛋白可顯著引發(fā)細胞周期的G2/M阻滯。細胞增殖實驗顯示293-p19細胞的DNA復制及細胞生長均受到顯著的抑制。此外,研究還發(fā)現(xiàn)p19可使人胚腎293細胞內的細胞周期調控蛋白的表達譜發(fā)生改變。其中包括上調cyclin

5、A1,CDK2,CDK4,CDK6,p27,cyclin D2,cyclin D3 and E2F1,及下調p15,cyclin A,cyclin B1和cyclin E1的表達。因此,我們的研究結果提示,p19有可能靶向多個周期相關調控蛋白從而引發(fā)細胞的G2/M阻滯。
　　 microRNA(miRNA)是一類大小為21-25nt的非編碼RNA,在轉錄后水平發(fā)揮基因的抑制作用。通常microRNA可通過抑制靶序列的翻譯,或引發(fā)

6、靶序列的降解來達到其負調控目的。雖然目前microRNA分子已知的很多,但真正明確其功能的卻很少。另外,有關microRNA對泡沫病毒作用的研究報道也極其有限。為此,我們利用生物信息學預測軟件對人泡沫病毒(HFV)基因組進行分析,發(fā)現(xiàn)}tFV的轉錄激活子Bell(Tas)的編碼區(qū)上有一個has-miR-491-5p的靶位點。將靶序列置于EGFP基因的3'非編碼區(qū)(UTR),用化學合成的及載體表達的has-miR-491-5p均可顯著抑制

7、EGFP的基因表達。用化學修飾的特異性miRNA抑制劑及過量表達p19,均可有效解救has-miR-491-5p引發(fā)的基因抑制。研究還發(fā)現(xiàn),has-miR-491-5p介導的基因抑制發(fā)生于轉錄后mRNA水平,而非蛋白質表達水平。不僅如此,has-miR-491-5p還可有效抑制Bell在質粒及病毒中的表達。該系統(tǒng)為進一步檢測has-miR-491-5p抑制}tFV病毒的復制奠定了基礎。
　　 總之,病毒早期感染產生的某些重要的調

8、控蛋白如Borf1和P19,不僅可作用于病毒基因組復制本身,而且還可作用于宿主細胞周期,通過改變周期蛋白的表達來引發(fā)細胞周期的阻抑。此外,宿主細胞對病毒的侵入性感染也呈現(xiàn)多種防御性作用機制,其中之一就是在細胞內引發(fā)針對病毒的miRNA介導的轉錄后水平的基因抑制。如miR-491對HFV Bell蛋白的抑制作用,就有可能是宿主miRNA通過限制轉錄激活因子的表達抑制HFV病毒的復制。miR-491介導的這種抑制作用有可能會為病毒建立潛伏感