Cx43及其組成的CJIC有多發(fā)性骨髓瘤干細胞與微環(huán)境相互影響中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分:多發(fā)性骨髓瘤干細胞樣細胞分選及生物學(xué)特性的初步分析
　　目的:探討分選多發(fā)性骨髓瘤干細胞(MM-TSCs)樣細胞的不同方法，并對不同方法分選出的細胞進行干細胞生物學(xué)特性的初步分析。
　　方法:采用免疫磁珠分選6例初診MM患者新鮮標本的CD138-細胞;常規(guī)培養(yǎng)4種骨髓瘤細胞株（RPMI8226、U266、XG-4、XG-7）;采用添加了表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF)的無血清培養(yǎng)法富集干細胞。

2、采用流式細胞術(shù)檢測不同方法得到細胞中SP細胞比例，并分選骨髓瘤細胞株P(guān)RIM8226中的SP細胞。對不同方法分離出的細胞進行干細胞生物學(xué)特性的鑒定:通過生長曲線、MTT檢測其增值情況;流式細胞術(shù)分析細胞周期;激光共聚焦顯微鏡觀察細胞表面CD38表達;集落形成實驗檢測其克隆形成能力;PCR檢測經(jīng)典干細胞基因的表達;裸鼠體內(nèi)成瘤試驗檢測細胞體內(nèi)成瘤能力。
　　結(jié)果:本研究成功分選6例初診MM患者新鮮標本中CD138細胞，檢測其SP細胞

3、比例分別為:1.42％、1.64％、1.37％、1.54％、1.71％、0.84％。檢測4種MM細胞株（RPMI8226、U266、XG-4、XG-7）中SP細胞比例分別為1.78±0.89％、0.825±0.53％、0.082±0.022％、0.177±0.05％;并成功分選PRIM8226中的SP細胞。經(jīng)添加細胞生長因子的無血清培養(yǎng)富集后SP細胞占3.65±0.51％。磁珠分選CD138-細胞、流式分選SP細胞及無血清富集后細胞生長

4、特點有所不同，但增殖能力無明顯差異。CD138-細胞、SP細胞及無血清富集細胞處于G0/G1期的細胞比例分別為30.41±1.3％、44.34±1.7％、36.15±1.1％;均高于NSP細胞(28.49±1.1％)，NSP組和CD138-組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)、NSP組和SP組、無血清富集組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。激光共聚焦顯微鏡下可見三種細胞均有CD38表達。集落形成實驗顯示:CD138-細胞、SP細胞及

5、無血清富集細胞都具有較強的集落形成能力。單細胞克隆直徑、克隆形成數(shù)、克隆形成率分別為:(0.198±0.022、0.280±0.016、0.215±0.010)、(708±81、1722±127、1124±105)、(35.4％、86.1％56.2％),三者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。三種細胞的集落形成能力均明顯高于NSP細胞(0.118±0.019、358±14、17.9％)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。RT-PCR結(jié)果

6、顯示三種細胞都有干細胞經(jīng)典標記c-myc、KIF4、SOX2、OCT4基因的表達，三種細胞同一基因表達率無顯著性差異(p＞0.05)。三種細胞干細胞相關(guān)基因表達均高于NSP細胞，表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示三種細胞均可在裸鼠體內(nèi)成瘤，成瘤所需最小細胞數(shù)數(shù)量級相同（成瘤所需最小細胞數(shù)分別為2*103、5*103、5*103），瘤體大小相似，成瘤能力無顯著性差異，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。對剝離

7、的瘤體進行了H&E染色病理鏡檢和抗人的CD138、CD34抗體標記的免疫組織化學(xué)染色及鏡檢。證明接種細胞形成腫瘤，瘤體來源于人的細胞，表達MM免疫標志CD138，瘤體內(nèi)新生血管起源于人的CD34+細胞。
　　結(jié)論:MM細胞株及MM患者新鮮標本中均存在一定比例SP細胞，免疫磁珠分選、流式細胞術(shù)分選及無血清富集方法均可分選出具有一定干細胞特性的細胞，從而成為分選MM腫瘤干細胞的方法。三種方法各有利弊，可結(jié)合使用。
　　第二部分:

8、Cx43及其組成的GJIC在骨髓微環(huán)境支持MM干/祖細胞生存中的作用及機制
　　目的:研究不同來源的骨髓間充質(zhì)干細胞對骨髓瘤干/祖細胞的生存及耐藥產(chǎn)生的作用，并探討連接蛋白CX43及其組成的GJIC在其中作用。
　　方法:1.分離培養(yǎng)患者來源(MM-MSCs)和正常對照的間充質(zhì)干細胞(ND-MSCs)，與RPMI8226細胞或流式細胞術(shù)分離的SP細胞建立直接共培養(yǎng)體系.2.在共培養(yǎng)體系中加入通道阻斷劑18α甘草次酸(α-GA

9、)前后分別通過生長曲線和MTT檢測其增值情況;流式細胞術(shù)分析SP細胞比例及細胞周期，檢測硼替佐米誘導(dǎo)的細胞凋亡;集落形成實驗檢測其克隆形成能力;RT-PCR檢測干細胞經(jīng)典標記c-myc、KIF4、SOX2、OCT4基因表達;裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測體內(nèi)成瘤能力。3.WesternBlot檢測Cx43蛋白表達水平及核蛋白P65的變化，分析G兒C與下游IKKB/NFkB信號通路變化的相關(guān)性，加入信號通路抑制劑后檢測信號通路的變化。
　　結(jié)

10、果:1.成功分離、培養(yǎng)獲得患者來源及正常對照的BMMSCs，二者在平均傳代時間、生長曲線、增殖能力無明顯差異;流式術(shù)檢測其細胞表型，均高表達CD73(98.0％)、CD44(100％)、CD90(99.8％)、CD105(100％)，不表達CD34(0.3％),HLA-DR(0.2％)等造血細胞表面標志;進行成骨及成脂誘導(dǎo)鑒定其具有多向分化能力。與流式術(shù)分選的SP細胞建立直接共培養(yǎng)體系。2.與正常對照ND-MSCs共培養(yǎng)相比，與患者來源

11、的BMMSCs與RPMI8226SP細胞直接共培養(yǎng)后SP細胞比例增加，促進其增殖;提高細胞周期中G0/G1期細胞比例;增加其體外克隆形成能力;并介導(dǎo)其對硼替佐米(BTZ)耐藥;部分上調(diào)干細胞相關(guān)基因表達水平;增加對裸鼠的體內(nèi)成瘤能力。而在共培養(yǎng)體系中加入通道阻滯劑，功能性阻斷細胞間通道連接后可使SP細胞比例下降，增殖活性減弱;處于G0/G1期細胞比例降低;降低體外克隆形成能力;部分恢復(fù)MM細胞對BTZ的敏感性;部分下調(diào)干細胞相關(guān)基因表達

12、水平;略降低對裸鼠的體內(nèi)成瘤能力。與對照組ND-MSCs共培養(yǎng)結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。3.MM-MSCs在蛋白水平上Cx43表達高于ND-MSCs，SP細胞在蛋白水平上Cx43表達低于NSP細胞。與MM-MSC共培養(yǎng)的SP細胞短時間內(nèi)CX43表達上調(diào)，但是與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。阻斷下游IKkB/NFkB信號通路后，通道阻斷劑作用減弱。
　　結(jié)論:患者來源的BMMSCs具有更強的促進骨髓瘤干細胞增殖

13、，并通過提高處于G0期細胞比例介導(dǎo)其對BTZ耐藥、增加集落形成率及裸鼠致瘤性的能力，其作用與GJIC功能密切相關(guān)，Cx43/NFkB信號通路可能是其作用機制之一。
　　第三部分:Cx43組成的GJIC在骨髓瘤干細胞誘導(dǎo)的微環(huán)境重塑中作用
　　目的:觀察MM干細胞誘導(dǎo)微環(huán)境重塑過程中發(fā)生EMT/MET轉(zhuǎn)化與Cx4343與其組成的GJIC的相關(guān)性及可能機制。
　　方法:采用流式細胞儀分選多發(fā)性骨髓瘤細胞株P(guān)RIM8226S

14、P細胞，與骨髓瘤患者來源(MM-MSCs)、正常對照來源的間充質(zhì)干細胞(ND-MSCs)及人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)共培養(yǎng)后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，細胞免疫熒光染色觀察上皮細胞標志蛋白和間質(zhì)細胞標志蛋白的表達MTT法檢測對SP細胞增殖的影響，WesternBlot方法檢測E-鈣黏蛋白、α-SMA蛋白表達變化，。檢測共培養(yǎng)后ERK1/2表達水平
　　結(jié)果:分選出的PRIM8226SP細胞與ND-MSCs、MM-MSCs

15、、HUVEC長期直接共培養(yǎng)后，MM-MSCs細胞及HUVEC細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，增殖速度增快。細胞免疫熒光染色及WesternBlot方法觀察了E-鈣黏蛋白、α-SMA蛋白表達變化，發(fā)現(xiàn)MM-MSCsE-鈣黏蛋白表達上調(diào)而α-SMA蛋白表達下調(diào);HUVEC細胞E-鈣黏蛋白表達下調(diào)而α-SMA蛋白表達上調(diào)。共培養(yǎng)后MM-MSCs的ERK1/2蛋白表達上調(diào)，而HUVEC的ERK1/2表達下調(diào)，加入通道阻滯劑后趨勢更加明顯。
　　結(jié)論