家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑研究.pdf

1、本研究在家蠶基因組計(jì)劃的基礎(chǔ)上，利用家蠶遺傳和生物信息學(xué)資源兩個(gè)平臺(tái)，以家蠶胰凝乳蛋白酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑(trypsininhibitor，TI)為主，對(duì)家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行了系統(tǒng)分析，主要內(nèi)容包括家蠶CI遺傳多態(tài)性、CI的分離、純化和基因克隆、家蠶SP和SPI的全基因組鑒定和表達(dá)特征，以及家蠶重要TI的基因克隆和功能分析等。取得的主要研究結(jié)果如下： 1.家蠶胰凝乳蛋白酶抑制劑的多態(tài)性研究 為了系統(tǒng)探明家蠶C

2、I的遺傳多態(tài)性和分布特征，我們首先對(duì)家蠶基因庫保存的434個(gè)家蠶品系血液樣品進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了由Ict-A、Ict-E、Ict-D、Ict-B、Ict-H五種基因支配的全部18種CIs，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了過去少有報(bào)道的Ict-B基因編碼的CI-9和CI-10，以及未見報(bào)道的未知遺傳基因編碼的CI-5、CI-11和CI-12等種類。 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，所有的品系至少分別擁有由Ict-A和Ict-D二個(gè)基因所編碼的CI的一種，推測(cè)Ict-A、Ic

3、t-D為家蠶所必需。9個(gè)品系中未檢查到由Ict-B和Ict-H兩個(gè)基因編碼的CI種類，推測(cè)它們?yōu)榉潜匦杌?。過去認(rèn)為Ict-E基因也是家蠶必需基因，根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了少數(shù)個(gè)體缺乏Ict-E基因編碼的CI-3和CI-4。因此，Ict-E基因也可能是家蠶非必需基因。 分析家蠶52個(gè)純系品系，發(fā)現(xiàn)多數(shù)CI種類在不同地理品系中的總體分布特征比較一致，但個(gè)別種類存在系統(tǒng)特異性。如CI-4和CI-9在中國(guó)系統(tǒng)中出現(xiàn)的頻率較日本系統(tǒng)的高

4、，而12個(gè)日本純系品系家蠶都未檢測(cè)到CI-4；CI-8在中國(guó)地方品種中含量低(7％)。聚類分析結(jié)果表明家蠶CI分布雖然沒有明顯的規(guī)律性，但來源相同的品系仍然有先聚在一起的趨勢(shì)。 2.家蠶胰蛋白酶抑制劑的多態(tài)性研究 首次調(diào)查了家蠶TI分布，在375個(gè)品系中共發(fā)現(xiàn)了9種TIs。特別是絲腺只特異表達(dá)TI無CI的現(xiàn)象，而主要在5齡幼蟲到結(jié)繭時(shí)期的中部絲腺檢測(cè)到活性，暗示其可能通過抑制絲腺的蛋白水解活性從而保護(hù)絲蛋白，或在組織溶解

5、過程中發(fā)揮作用。統(tǒng)計(jì)80個(gè)中國(guó)和日本系統(tǒng)的TI分布，發(fā)現(xiàn)TI-4在中國(guó)系統(tǒng)中出現(xiàn)的頻率高，而TI-b3主要存在于日本品系中，表明個(gè)別TI存在系統(tǒng)特異性。 3.家蠶胰凝乳蛋白酶抑制劑(CI-9)的分離純化、理化性質(zhì)和基因克隆研究 以尚未純化的高比活性CI-9為目標(biāo)，經(jīng)過反復(fù)摸索，建立了以硫酸銨沉淀、Butyl-Toyopear1650M疏水層析、2次SephadexG-50凝膠過濾層析和Chymotrypsin-Seoha

6、rose4B親和層析為主要步驟的純化方法，并最終從b40品系中獲得了單一的活性穩(wěn)定的CI-9樣品，其純化效率為比活性1819倍，絕對(duì)回收率為4％。TOFMass測(cè)定CI-9的分子量為7176Da，理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果顯示其對(duì)溫度(～100℃)和pH(pH1～12)穩(wěn)定，等電點(diǎn)(pI)為4.3。N末端氨基酸序列分析獲得40個(gè)殘基序列，發(fā)現(xiàn)該抑制劑活性中心為AYF，為一種新類型低分子Kunitz型CI。克隆獲得了編碼CI-9的基因片段，長(zhǎng)度為5

7、98bp，并至少含有一個(gè)內(nèi)含子。經(jīng)信息分析，得知CI-9由62個(gè)氨基酸殘基組成。 4.家蠶絲氨酸蛋白酶的全基因組鑒定分析 以家蠶全基因組精細(xì)圖譜為基礎(chǔ)，對(duì)家蠶絲氨酸蛋白酶進(jìn)行了鑒定。共鑒定了143個(gè)家蠶絲氨酸蛋白酶基因，命名為BmSP1～BmSP143，其中有80(55.9％)個(gè)基因具有ESTs證據(jù)。這些基因中，除20個(gè)基因已經(jīng)被報(bào)道或登錄外，其余123個(gè)為新鑒定基因。信息分析發(fā)現(xiàn)這些基因所編碼蛋白的分子量從數(shù)kDa到數(shù)

8、百kDa，等電點(diǎn)從3.5～11不等。143個(gè)基因中，51個(gè)具有包括Ser、His和Asp殘基的完整活性位點(diǎn)，其余具有非完整的活性位點(diǎn)。染色體定位結(jié)果，有128個(gè)基因能定位到家蠶的26條染色體上，且分布不均勻。第5號(hào)、7號(hào)和16號(hào)染色體擁有較多的基因，分別為11、13、10個(gè)。特別是，家蠶絲氨酸蛋白酶基因具有串聯(lián)重復(fù)分布現(xiàn)象，如BmSP74、BmSP143、BmSP18、BmSP142、BmSP103、BmSP40、BmSP53和BmSP

9、39等8個(gè)基因在16號(hào)染色體上呈串聯(lián)重復(fù)分布，且基因序列相似，估計(jì)來源于基因的重復(fù)事件。 5.家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑的全基因組鑒定分析 分析發(fā)現(xiàn)，在家蠶基因組中至少存在56種絲氨酸蛋白酶抑制劑基因，系統(tǒng)命名為：BmSPI1～BmSPI56，且49個(gè)(87.5％)基因具有ESTs證據(jù)。56個(gè)基因中有18個(gè)與己報(bào)道的基因序列一致或者高度相似，其余38個(gè)為新鑒定SPI基因。共計(jì)有49個(gè)基因都能定位到染色體上，分布同樣不勻：第3

10、號(hào)、第22號(hào)和第28號(hào)染色體，分別擁有10、6、7個(gè)基因，并且在第2、3、7、15、22和28號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)重復(fù)群，分別含有2～8個(gè)序列相似、來自于基因重復(fù)的成員。特別重要的是，通過信息分析鑒定了藤井發(fā)現(xiàn)的Ict-A、Ict-B、Ict-D、Ict-E和Ict-H五個(gè)遺傳位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因組序列，其對(duì)應(yīng)關(guān)系為：BmSPI48對(duì)應(yīng)Ict-A，BmSPI54對(duì)應(yīng)Ict-B，BmSPI40對(duì)應(yīng)Ict-D，BmSPI38對(duì)應(yīng)Ict-E，Bm

11、SPI55對(duì)應(yīng)Ict-H。尤其是，根據(jù)遺傳分析發(fā)現(xiàn)Ict-A、Ict-B加和Ict-H三個(gè)位點(diǎn)來自于相同祖先，各位點(diǎn)分別至少擁有2、2和3個(gè)重復(fù)基因。以基因組信息為基礎(chǔ)，我們推測(cè)Ict-H位點(diǎn)在所有位點(diǎn)中變異最活躍，其功能也正在發(fā)生分化，而Ict-A為3個(gè)位點(diǎn)中唯一的必須基因位點(diǎn)，進(jìn)化歷史最為古老。 6.家蠶絲氨酸蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)特征分析 利用家蠶全基因組芯片和表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)，對(duì)56個(gè)家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑中有探針的

12、39個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)家蠶SPI的表達(dá)具有組織和發(fā)育時(shí)期特異性：凡是含有Kunitz_BPTI、Zona_pellucida和Thyroglobulin_1功能域的CIs在各組織的表達(dá)量均極低，而含有I-set功能域的BMSPI22則在多個(gè)組織器官中均呈現(xiàn)高豐度表達(dá)，5個(gè)含有Kazal功能域的絲氨酸蛋白酶抑制劑主要集中表達(dá)于頭、表皮及血細(xì)胞等組織器官中等。分析還發(fā)現(xiàn)了CI-8在馬氏管特異表達(dá)，而BmSPI24、BmSPI9、B

13、mSPI19和BmSPI29則在絲腺特異表達(dá)，可能意味著它們分別與免疫和絲蛋白合成有密切的聯(lián)系。特別重要的是，對(duì)第2、3、7、15、22、23、25和28號(hào)染色體上10個(gè)重復(fù)基因群進(jìn)行分析表明，凡是屬于來自于同一個(gè)基因重復(fù)事件的基因，它們都具有非常一致的表達(dá)特征，例外極少。進(jìn)一步說明家蠶SPI豐富的多態(tài)性來自于基因重復(fù)，同一重復(fù)群的基因序列和表達(dá)特征相似，可能具有相同的功能。 同樣，對(duì)107個(gè)家蠶絲氨酸蛋白酶基因進(jìn)行了表達(dá)圖譜分

14、析，發(fā)現(xiàn)了5種典型的組織和器官特異表達(dá)模式，而在發(fā)育變態(tài)過程中的模式主要分為兩類，一類是整個(gè)發(fā)育變態(tài)過程遍在表達(dá)，一類是僅在化蛹前表達(dá)。但與家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑基因顯著不同的是，其重復(fù)基因群并不具有相同的表達(dá)模式，反之亦然，具有相同表達(dá)模式的并不是重復(fù)基因群。 7.家蠶絲氨酸蛋白酶及抑制劑的微生物誘導(dǎo)表達(dá)特征分析 為了分析家蠶絲氨酸蛋白酶及其抑制劑與家蠶病原微生物抵抗之間的可能關(guān)系，我們分別利用大腸桿菌(E.coli)

15、、細(xì)菌黑胸?cái)⊙?B.thuringiensis)、白僵菌(B.bassiana)和家蠶NPV病毒進(jìn)行感染誘導(dǎo)，并分析了表達(dá)譜的變化。結(jié)果顯示，有25個(gè)絲氨酸蛋白酶基因和15個(gè)抑制劑基因誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。有趣的是，BmSPI9對(duì)大腸桿菌和白僵菌誘導(dǎo)特別敏感，而BmSPI17對(duì)于NPV的誘導(dǎo)敏感，由此推測(cè)這兩個(gè)基因可能與家蠶的防御體系具有十分重要的功能。 8.絲腺特異表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制劑的克隆及原核表達(dá) 為了進(jìn)一步分析絲腺特

16、異表達(dá)的BmSPI9、BmSPI19和BmSPI29三個(gè)基因，我們首先利用RT-PCR分析了三個(gè)基因的組織表達(dá)譜。結(jié)果顯示，BmSPI9除在體壁中有表達(dá)外，主要集中在整個(gè)絲腺表達(dá)；BmSPI19主要集中在中部絲腺表達(dá)，以中部絲腺后段表達(dá)量最高；而BmSPI29則只在中部絲腺前段部位表達(dá)。其次，我們對(duì)該三個(gè)基因進(jìn)行了TA克隆，獲得了全長(zhǎng)cDNA序列。同時(shí)構(gòu)建了BmSPI29基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)了目的蛋白，經(jīng)分離純化，獲得

17、了較純BmSPI29蛋白樣品。絲腺是家蠶合成絲蛋白的唯一器官，我們期待通過其特異的絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究，為探索絲蛋白合成相關(guān)的分子機(jī)制提供幫助。 9.主要鱗翅目昆蟲胰凝乳蛋白酶抑制劑的多態(tài)性分析 對(duì)棉鈴蟲、菜粉蝶等20余種主要鱗翅目害蟲的血液和18個(gè)蓖麻蠶品種的血液以及不同組織的CI和TI種類分布進(jìn)行了初步調(diào)查，并與家蠶的CI和TI種類進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)野外鱗翅目害蟲所含的CI大多集中在等電點(diǎn)4.5～9.0之間，物種間