HBx蛋白和CIITA轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)遺傳沉默在調(diào)控HepG2與L02細(xì)胞HLA-DR表達(dá)中的作用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染已成為全球范圍的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題。HBV感染與原發(fā)性肝細(xì)胞癌關(guān)系密切，是我國(guó)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要病因之一，而HBV感染導(dǎo)致肝癌發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制至今尚未闡明。
　　 宿主免疫應(yīng)答水平是影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的主要因素之一。肝癌細(xì)胞免疫逃逸在原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，探討肝癌細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制有助于制定針對(duì)肝癌免疫治療的策略。主要組織相容性Ⅱ類分子(m

2、ajor histocompatibilitycomplexⅡ，MHC-Ⅱ)通過(guò)向Th細(xì)胞提呈外來(lái)抗原，在抗感染和抗腫瘤免疫中起重要作用?，F(xiàn)有研究表明，腫瘤細(xì)胞缺乏HLA-DR(human leukocyte antigen DR，HLA-DR)表達(dá)是乳腺癌、結(jié)腸癌等發(fā)生免疫逃逸的重要機(jī)制之一。Ⅱ類反式激活因子(ClassⅡtransactivator，CIITA)是調(diào)控HLA-DR表達(dá)的“限速因子”，在調(diào)控HLA-DR表達(dá)與否及水平中

3、起決定作用。報(bào)道指出，胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞中CIITA表達(dá)缺失是其缺乏誘導(dǎo)性HLA-DR表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者癌組織中的肝癌細(xì)胞缺乏CIITA與HLA-DR表達(dá)，而相應(yīng)的癌周肝組織中的肝細(xì)胞存在不同程度的CIITA與HLA-DR表達(dá)，提示肝癌細(xì)胞缺乏HLA-DR表達(dá)可能與CIITA基因表達(dá)沉默有關(guān)、并在肝癌細(xì)胞免疫逃逸中起重要作用。然而，肝癌細(xì)胞CIITA基因表達(dá)沉默的機(jī)制尚未闡明。
　

4、　 宿主基因啟動(dòng)子DNA甲基化和/或組蛋白的去乙?；菍?dǎo)致宿主基因表達(dá)沉默的重要機(jī)制。已有研究顯示，部分腫瘤細(xì)胞CIITA啟動(dòng)子Ⅳ甲基化和/或組蛋白去乙?；菍?dǎo)致腫瘤細(xì)胞CIITA表達(dá)沉默和HLA-DR表達(dá)缺乏的關(guān)鍵表觀遺傳機(jī)制。在不同的腫瘤細(xì)胞中，導(dǎo)致CIITA基因轉(zhuǎn)錄沉默的表觀遺傳機(jī)制存在差異，在黑色素瘤細(xì)胞中由其啟動(dòng)子Ⅳ組蛋白去乙酰化所致，與甲基化無(wú)關(guān)；在胃癌、結(jié)腸癌細(xì)胞中則由其啟動(dòng)子Ⅳ甲基化單獨(dú)所致；在白血病細(xì)胞中則由其啟動(dòng)子

5、Ⅳ甲基化和組蛋白去乙酰化共同調(diào)控。在肝癌細(xì)胞中，與HLA-DR表達(dá)缺失相關(guān)的CIITA基因表觀遺傳沉默機(jī)制目前尚缺少研究。
　　 HBV基因組含有4個(gè)開放讀碼框架，其中X區(qū)所編碼的產(chǎn)物HBx蛋白是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白，具有廣泛的反式激活功能，既可激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，又可直接作用于細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，還能通過(guò)上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；傅鹊谋磉_(dá)參與宿主基因的表觀遺傳調(diào)節(jié)，導(dǎo)致宿主基因的表觀遺傳沉默。近年研究發(fā)現(xiàn)X基因及其產(chǎn)物X蛋

6、白與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)，而HBx蛋白對(duì)抑癌基因的表觀遺傳修飾調(diào)控導(dǎo)致的基因沉默被認(rèn)為是原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。由此推測(cè)，HBx蛋白有可能通過(guò)上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；傅鹊谋磉_(dá)參與誘導(dǎo)肝細(xì)胞或肝癌細(xì)胞CIITA基因轉(zhuǎn)錄表觀遺傳沉默。然而，HBx蛋白在調(diào)控肝細(xì)胞CIITA基因轉(zhuǎn)錄表觀遺傳沉默與HLA-DR表達(dá)中的作用尚無(wú)研究報(bào)道。
　　 首先，我們檢測(cè)人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞株HepG2

7、細(xì)胞中基礎(chǔ)性及IFN-γ誘導(dǎo)性CIITA和HLA-DR的表達(dá)狀況，并分析CIITA基因cDNA轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞HLA-DR表達(dá)的影響，從而探討HepG2細(xì)胞缺乏HLA-DR表達(dá)與CIITA基因表達(dá)沉默的關(guān)系；然后，采用MSP和ChIP技術(shù)檢測(cè)L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中CIITA啟動(dòng)子Ⅳ的DNA甲基化和組蛋白H3乙酰化狀態(tài)，并分析甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR和組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA對(duì)HepG2細(xì)胞CIITA與HLA-DR

8、表達(dá)的影響，從而探討CIITA啟動(dòng)子Ⅳ DNA甲基化和組蛋白H3去乙酰化在調(diào)控HepG2細(xì)胞CIITA與HLA-DR表達(dá)中的作用；最后，構(gòu)建HBV X基因真核表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞與HepG2細(xì)胞，探討HBx蛋白對(duì)L02細(xì)胞與HepG2細(xì)胞CIITA和HLA-DR表達(dá)的影響。
　　 主要研究結(jié)果
　　 1、L02細(xì)胞中未檢測(cè)到CIITA和HLA-DR的基礎(chǔ)性表達(dá)，通過(guò)IFN-γ的刺激后檢測(cè)到了CIITA和HLA-

9、DR mRNA和蛋白的表達(dá)，且CIITA和HLA-DR的表達(dá)與IFN-γ呈一定的時(shí)間劑量依賴關(guān)系。HepG2細(xì)胞中，則未檢測(cè)到CIITA和HLA-DR的基礎(chǔ)性及IFN-γ誘導(dǎo)性表達(dá)。通過(guò)將CIITA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，檢測(cè)到HLA-DR的表達(dá)，轉(zhuǎn)染空載體及HepG2細(xì)胞本身未檢測(cè)到HLA-DR的表達(dá)。
　　 2、L02細(xì)胞中CIITA啟動(dòng)子Ⅳ DNA呈非甲基化狀態(tài)，組蛋白H3呈乙?；癄顟B(tài)，HepG2細(xì)胞中CIITA

10、啟動(dòng)子Ⅳ DNA呈半甲基化狀態(tài)，組蛋白H3呈去乙?；癄顟B(tài)。通過(guò)采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR和組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA單獨(dú)及聯(lián)合處理HepG2細(xì)胞后，結(jié)果顯示TSA和5-Aza-CdR單獨(dú)處理及兩者聯(lián)合處理，均能恢復(fù)IFN-γ誘導(dǎo)性CIITA mRNA的表達(dá)，以TSA單獨(dú)處理組相對(duì)定量為1，5-Aza-CdR單獨(dú)處理組相對(duì)值為1.15±0.27，兩者聯(lián)合處理組相對(duì)定量值為2.13±0.22，顯著高于單獨(dú)處理組，P<0.

11、05；經(jīng)5-Aza-CdR處理后恢復(fù)了HLA-DR蛋白的誘導(dǎo)性表達(dá)，經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，其表達(dá)率達(dá)11.9%±1.78%；經(jīng)TSA處理后，HLA-DR蛋白的誘導(dǎo)性表達(dá)率達(dá)9.31%±2.24%；經(jīng)兩者聯(lián)合處理后，HLA-DR蛋白的誘導(dǎo)性表達(dá)率達(dá)28.5%±2.81%，較兩者單獨(dú)處理明顯升高(P<0.05)。
　　 3、構(gòu)建HBV X基因真核表達(dá)載體，通過(guò)電穿孔方法轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染了HBVX基因的L02細(xì)胞中

12、檢測(cè)到了CIITA和HLA-DR的表達(dá)，同時(shí)，轉(zhuǎn)染了HBV X基因的HepG2也檢測(cè)到了HLA-DR的表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1、CIITA基因表達(dá)沉默是導(dǎo)致HepG2細(xì)胞缺乏基礎(chǔ)性與IFN-γ誘導(dǎo)性HLA-DR表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制；
　　 2、CIITA啟動(dòng)子Ⅳ的DNA甲基化和組蛋白H3去乙酰化修飾在導(dǎo)致HepG2細(xì)胞CHTA基因轉(zhuǎn)錄表觀遺傳沉默及HLA-DR表達(dá)缺失中均起重要作用，并可能是導(dǎo)致肝癌細(xì)胞免疫逃逸的重