ZD6474對Imatinib耐藥的慢性粒細(xì)胞性白血病的抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia，CML)特征性的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志是9號(hào)和22號(hào)染色體易位形成的費(fèi)城染色體(Ph染色體)。它是c—Abl基因的第一個(gè)外顯子被bcr基因所替代，產(chǎn)生BCR—ABL癌基因，編碼分子量為210 KDa的Bcr—Abl蛋白，后者在CML的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。Bcr—Abl蛋白可通過持續(xù)激活的酪氨酸激酶活化下游相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括Ras/MAPK、PI3K

2、/AKT、ERK、NF—κB、JAK—STAT通路等，誘導(dǎo)產(chǎn)生不依賴生長因子的細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致白血病的產(chǎn)生。 Imatinib mesylate(又稱為伊馬替尼，ST1571，Gleevec，格列衛(wèi))的應(yīng)用，極大的提高了慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)的治療效果，其靶向抑制引起CML的特征性分子—Bcr—Abl酪氨酸激酶，而不影響其他正常的細(xì)胞。目前已經(jīng)成為臨床上治療CML的一線用藥。然而，隨著Imatinib的應(yīng)用，

3、耐藥和復(fù)發(fā)成為限制其療效的主要原因。耐藥的主要原因包括：Bcr—Ab1基因的擴(kuò)增或過表達(dá)、點(diǎn)突變，P—gp蛋白表達(dá)增高，以及不依賴Bcr—Ab1激酶的耐藥機(jī)制等。其中Src家族激酶的過表達(dá)在不依賴Bcr—Ab1激酶的耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。隨著分子靶向治療研究的深入發(fā)展，目前普遍認(rèn)為：同時(shí)抑制多個(gè)酪氨酸激酶活性的小分子抑制劑可能比單靶點(diǎn)抑制劑的治療效果更為顯著。 ZD6474(ZactimaTM、Vandetanib)是一種苯

4、胺基喹唑啉化合物，為口服的小分子酪氨酸激酶抑制劑，由AstraZeneca制藥公司研發(fā)。除了抑制VEGFR和EGFR之外，ZD6474還同時(shí)抑制多種酪氨酸激酶的活性。臨床前實(shí)驗(yàn)和Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ZD6474在多種實(shí)體瘤(如非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等)中顯示了顯著的抗腫瘤活性，口服具有很好的耐受性。目前該藥正在進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌的Ⅲ期臨床試驗(yàn)。有研究證實(shí)ZD6474可以抑制EOL-1，MV4-11，Kasumi-1等

5、白血病細(xì)胞的增殖，但是還沒有關(guān)于ZD6474對CML的體外、體內(nèi)治療研究。 K562細(xì)胞株系人CML急性變期細(xì)胞株，既具有急性白血病細(xì)胞的特點(diǎn)，又具有CML細(xì)胞特有的本質(zhì)，是體外篩選抗白血病藥物、研究其療效及機(jī)制的首選細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)研究ZD6474對體外培養(yǎng)的人類紅白血病細(xì)胞系K562的殺傷作用，及對其衍牛的Imatinib耐藥細(xì)胞株K562/G和多藥耐藥細(xì)胞株K562/A的抗增殖作用，探討其可能存在的分子機(jī)制，研究ZD64

6、74的體內(nèi)抗白血病作用，同時(shí)研究了Src激酶在誘導(dǎo)Imatinib耐藥中的作用，證實(shí)抑制Src激酶可以有效地誘導(dǎo)耐藥K562細(xì)胞及親代K562細(xì)胞凋亡。 方法： 1.我們通過逐漸增加藥物濃度的方法成功誘導(dǎo)Imatinib耐藥細(xì)胞株K562/G，同樣方法用阿霉素誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞K562/A。WST方法證實(shí)耐藥誘導(dǎo)成功，流式細(xì)胞儀分析Imatinib對細(xì)胞周期的影響。Western blot方法檢測耐藥株中明顯變化的分子。

7、 2.WST法檢測ZD6474對K562、K562/G和K562/A細(xì)胞活力的影響，流式細(xì)胞儀檢測ZD6474對細(xì)胞周期的影響。 3.采用RT—PCR和Western blot方法分析ZD6474誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡可能存在的分子機(jī)制，利用體外重組Src激酶檢測ZD6474對Src激酶的直接抑制作用。 4.應(yīng)用Src激酶特異抑制劑PP2，檢測Src激酶在誘導(dǎo)Imatinib耐藥中的作用。 5.利用FuGENE

8、()HD轉(zhuǎn)染試劑在K562細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染攜帶Src基因的pcDNA3.1(—)質(zhì)粒，使Src激酶過表達(dá)，檢測Src激酶過表達(dá)對Bcl—2表達(dá)的影響，WST法檢測過表達(dá)Src激酶后，細(xì)胞對Imatinib敏感性的變化。通過RNA干擾技術(shù)沉默K562/G細(xì)胞中Src基因，檢測干擾Src激酶表達(dá)之后細(xì)胞活力的變化。 6.建立K562、K562/G和K562/A細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤模型，利用灌胃給藥的方式給予ZD6474，連續(xù)給藥18天

9、，觀察移植瘤生長情況，并用免疫組化方法分析腫瘤細(xì)胞的增殖和Src激酶的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.本研究中分別用Imatinib和阿霉素誘導(dǎo)K562細(xì)胞，建立了對Imatinib耐藥的K562/G細(xì)胞株和多藥耐藥細(xì)胞株K562/A。與K562細(xì)胞相比，10μM的Imatinib不能抑制K562/G細(xì)胞增殖，顯示了大于30倍的耐藥，K562/A細(xì)胞顯示了大于3倍的耐藥。Imatinib不能誘導(dǎo)K562/G和K562/A細(xì)胞阻滯

10、于G0/G1期。Western blot結(jié)果表明，K562/G和K562/A細(xì)胞中磷酸化Src(p—Src)表達(dá)顯著升高，同時(shí)Bcl—2和p—STAT3的表達(dá)也有所增高。 2.ZD6474作用于K562、K562/G和K562/A細(xì)胞48小時(shí)，其抑制細(xì)胞生長增殖的IC50分別為1.61μM、3.18μM和2.47μM。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，ZD6474抑制CML細(xì)胞增殖的作用與誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯有關(guān)，6μM ZD6474

11、處理細(xì)胞24小時(shí)，處于G0/G1期的細(xì)胞分別由40.2％、29.9％和25％提高至76.3％、55.2％和54.2％(P<0.05)，伴隨處于S期和G2-M期細(xì)胞的相應(yīng)減少。 3.ZD6474呈劑量依賴的方式誘導(dǎo)K562、K562/G和K562/A細(xì)胞中PARP蛋白的裂解，證實(shí)其可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體外激酶測定結(jié)果表明，ZD6474可以直接抑制Src激酶活性，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Src蛋白的表達(dá)和磷酸化。ZD6474在抑制Src激酶活性

12、的濃度可以顯著誘導(dǎo)CML細(xì)胞的凋亡，提示其誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡與抑制Src激酶活性有關(guān)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，ZD6474還通過上調(diào)Bcl—2家族中Bax/Bcl—2的比例，以及下調(diào)p—STAT3的表達(dá)起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。 4.利用Src激酶特異的抑制劑PP2處理K562、K562/G和K562/A細(xì)胞24小時(shí)，可引起細(xì)胞凋亡，下調(diào)Bcl—2表達(dá)，證實(shí)抑制Src激酶可以誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡，下調(diào)Bcl—2表達(dá)，而PP2對p—STAT3

13、的表達(dá)沒有影響，推測p—STAT3的激活并非都是由Src激酶所引起。 5.在K562細(xì)胞中高表達(dá)的Src激酶，可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生對Imatinib的耐受及上調(diào)Bcl—2的表達(dá)。而在K562/G中用RNA干擾技術(shù)沉默Src激酶，可以抑制47％(24小時(shí))和53％(48小時(shí))的K562/G細(xì)胞增殖。 6.以25-100mg/kg/day的ZD6474每日一次口服給藥，可以顯著抑制K562、K562/G和K562/A裸鼠移植瘤的

14、生長(P<0.05)；腫瘤組織免疫組化分析顯示，ZD6474可以抑制腫瘤組織中Src激酶的表達(dá)。 結(jié)論： 本研究中分別用Imatinib和阿霉素誘導(dǎo)K562細(xì)胞，建立了對Imatinib耐藥的K562/G細(xì)胞株和多藥耐藥細(xì)胞株K562/A。Western blot檢測其耐藥機(jī)制主要與p—Src過度表達(dá)，以及Bcl—2和p—STAT3上調(diào)有關(guān)。ZD6474可以劑量依賴性抑制K562、K562/G和K562/A細(xì)胞增殖，其機(jī)

15、制與誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡有關(guān)。進(jìn)一步探討分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，ZD6474誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制主要是通過抑制Src激酶活性，上調(diào)Bax/Bcl—2比例，并抑制p—STAT3活性所致。Src激酶特異抑制劑PP2的應(yīng)用，證實(shí)Src激酶在誘導(dǎo)Imatinib耐藥和上調(diào)Bcl—2中起重要作用。K562細(xì)胞中過表達(dá)Src激酶，可以成功誘導(dǎo)K562細(xì)胞對Imatinib耐藥。用RNA干擾方法抑制K562/G細(xì)胞中的Src激酶，可顯著抑制K562/G細(xì)胞增殖。Z