4-1BB-4-1BBL雙向信號(hào)在免疫調(diào)節(jié)中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、本文首先克隆了人全長(zhǎng)4-1BBL分子，建立了4-18BL轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，并以此為免疫原，成功研制了兩株具有不同抗原識(shí)別位點(diǎn)及功能的抗人4-1BBL單克隆抗體。在上述基礎(chǔ)上還探討了4-188／4-1BBL雙向信號(hào)對(duì)T細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)理，4-188／4-1BBL雙向信號(hào)在單核細(xì)胞分化發(fā)育中的作用及涉及的分子。進(jìn)而，提出了4-1BB／4-18BL雙向信號(hào)介導(dǎo)免疫應(yīng)答中單核細(xì)胞、DC和T細(xì)胞之間相互作用的新的模型假說(shuō)。 一、人4

2、．1BBL分子的克隆、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制。 1.人4-1BBL基因的克隆和逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。 根據(jù)4—1BBL基因(GeneBank：gi：24119163)序列，利用RT-PCR方法從活化T細(xì)胞中克隆了全長(zhǎng)4-1BBL基因，通過(guò)基因克隆技術(shù)，將其插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term。進(jìn)一步通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組表達(dá)載體與輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，用其培養(yǎng)上清感染L929細(xì)胞72h

3、后，經(jīng)Zeocin篩選出穩(wěn)定表達(dá)4．1BBL分子的L929細(xì)胞株(L929／4．1BBL)。經(jīng)體外長(zhǎng)期傳代和液氮反復(fù)凍存和復(fù)蘇，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長(zhǎng)良好，4。lBBL的表達(dá)穩(wěn)定在95％以上。 2.鼠抗人4-1BBL單克隆抗體的研制。 以L929／4．1BBL細(xì)胞作為免疫原，免疫Balb／c小鼠。采用B淋巴瘤雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟和小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0進(jìn)行融合，經(jīng)HAT篩選后，以FACS分析篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)過(guò)3次亞克隆

4、及反復(fù)篩選，最終得到兩株持續(xù)分泌抗人4—1BBL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(3Ell和2C7)，經(jīng)快速定性試紙分析，結(jié)果顯示，McAb3Ell和McAb2C7的Ig類別均為IgGl。經(jīng)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)和液氮凍存，復(fù)蘇的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好，穩(wěn)定分泌抗體。采用本室建立的腹水誘生和純化方案誘生腹水，3Ell，2C7腹水型單抗的效價(jià)>1：1000。3Ell和2C7腹水經(jīng)ProteinG親和層析分離純化，濃度為0．9—1．2mg／ml。純化后抗體蛋白用

5、于間接免疫熒光分析的用量為0．25-2．0μg/l×106細(xì)胞。 3.鼠抗人4-1BBL單克隆抗體生物學(xué)特性的研究。 為了研究McAb3E11和McAb2C7對(duì)4．1BBL分子表達(dá)細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合特性，選擇表達(dá)4．1BBL膜分子的U266、U937、Daudi和Jurkat，通過(guò)間接免疫熒光標(biāo)記法及流式細(xì)胞儀(FCM)分析，結(jié)果顯示，McAb3E11和McAb2C7能特異性地識(shí)別不同細(xì)胞表達(dá)的4．1BBL分子。L929／

6、4-1BBL為競(jìng)爭(zhēng)靶細(xì)胞，采用競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)分析3Ell和2C7的抗原識(shí)別位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，McAb3E11和McAb2C7與商品化4—1BBLMcAb識(shí)別的抗原位點(diǎn)不完全相同，且McAb3E11和McAb2C7之間的識(shí)別位點(diǎn)也不相同。因此，這兩株識(shí)別位點(diǎn)不同的抗體可以為研制可溶性4．1BBL的ELISA試劑盒奠定重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。3H-TdR摻入法分析證實(shí)，McAb3E11與McAb2C7均能誘導(dǎo)單核細(xì)胞的體外增殖，且3E11具有更強(qiáng)的

7、促增殖效應(yīng)。 二、4．1BB／4．1BBL雙向信號(hào)在T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)中的作用。 首先動(dòng)態(tài)檢測(cè)了4．1BB和4一lBBL分子在T細(xì)胞活化過(guò)程中的表達(dá)。FACS分析結(jié)果顯示，T細(xì)胞活化12h即可檢測(cè)到4．1BB在細(xì)胞膜上較高水平的表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平不斷提高，第3天時(shí)達(dá)高峰，隨后有逐趨下降，但仍維持較高水平的表達(dá)。而4—1BBL分子在第2天時(shí)才被檢測(cè)到在T細(xì)胞上開(kāi)始表達(dá)，在第3天時(shí)達(dá)高峰，隨后有微弱下降趨勢(shì)，但仍維持一

8、定水平的表達(dá)。由此表明，活化T細(xì)胞可上調(diào)表達(dá)4．1BB和4．1BBL，并在活化的高峰期呈現(xiàn)共表達(dá)。 在此基礎(chǔ)上，探討了4．1BB／4．1BBL正向信號(hào)的對(duì)T細(xì)胞作用。3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L929／4．1BBL細(xì)胞較L929／mock細(xì)胞能有效地促進(jìn)CD3McAb預(yù)活化的T細(xì)胞增殖。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清，結(jié)果顯示，在L929／4．1BBL的作用下，在T細(xì)胞的培養(yǎng)上清中IL-2和IFN-γ的分泌水平明顯上升，而且隨培

9、養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。T細(xì)胞活化2d后，F(xiàn)ACS分析T細(xì)胞表型顯示，L929／4．1BBL下調(diào)活化T細(xì)胞表達(dá)CD95和PD．1。而且L929／4．1BBL還能協(xié)同CD28McAb促進(jìn)T細(xì)胞活化。繼而，我們探討了4—1BB／4．1BBL逆向信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的作用。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，McAblFl(由于MoAb1Fl和McAb3E1l均可激發(fā)4．1BBL逆向信號(hào)，故文中只給出了采用MoAb1Fl的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下同)可明顯抑制CD3McAb聯(lián)合CD2

10、8MeAb對(duì)T細(xì)胞的增殖效應(yīng)。用AnnexinV和PI雙標(biāo)記后，F(xiàn)ACS分析表明，McAb1Fl可誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞發(fā)生大量凋亡。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清結(jié)果顯示，McAb1Fl作用組T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的水平明顯低于對(duì)照組。T細(xì)胞經(jīng)McAb1F1刺激3d，用anti-CD95-PE和anti-PD．1．PE標(biāo)記及FACS分析型顯示，T細(xì)胞上調(diào)表達(dá)CD95和PD-1。 三、4-1BB/4-1BBL逆向信號(hào)對(duì)單核細(xì)胞的效

11、應(yīng)。 1.4-1BB／4-1BBL逆向信號(hào)對(duì)單核細(xì)胞的促增殖效應(yīng)。 首先，3H-TdR摻入法分析人外周血單核細(xì)胞的體外增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)，McAb1Fl能通過(guò)激發(fā)4．1BBL逆向信號(hào)促進(jìn)表達(dá)4．1BBL的人外周血單核細(xì)胞的大量擴(kuò)增。進(jìn)而的實(shí)驗(yàn)顯示，MeAb1Fl能促進(jìn)單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子M-CSF、GM-CSF、FL和IL-6等。由此推測(cè)，4．1BBL逆向信號(hào)可能是通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞分泌的這些細(xì)胞因子的協(xié)同作用介導(dǎo)了單核細(xì)胞的增

12、殖。進(jìn)而，我們探討了4．1BBL逆向信號(hào)通路的分子機(jī)制。業(yè)已證實(shí)，4—1BBL分子的胞漿段僅14個(gè)氨基酸但存在CKl激酶的磷酸化位點(diǎn)，由此推測(cè)4．1BBL逆向信號(hào)的傳導(dǎo)可能與CKl激酶有關(guān)。3H-TdR摻入法分析證實(shí)，CKl激酶抑制劑IC261能顯著抑制MeAb1Fl誘導(dǎo)的單核細(xì)胞的體外增殖。采用激光共聚焦顯微鏡觀察到經(jīng)MeAb1Fl作用的單核細(xì)胞30min后，胞漿NF-κB產(chǎn)生核轉(zhuǎn)位，60min后大部分NF-κB分子已從胞漿轉(zhuǎn)移到核內(nèi)

13、，而IC261能顯著抑制McAb1Fl誘導(dǎo)的NF—KB核轉(zhuǎn)位。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在介導(dǎo)單核細(xì)胞增殖的4．1BBL逆向信號(hào)通路中，4．1BBL的CKl磷酸化和NF．KB核轉(zhuǎn)位存在關(guān)聯(lián)性。 2.4-1BB／4-1BBL逆向信號(hào)在單核細(xì)胞向Mo-DC分化誘導(dǎo)中的作用。 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討抗體介導(dǎo)的4．1BBL逆向信號(hào)對(duì)人外周血單核細(xì)胞分化為DCs的作用。結(jié)果顯示，McAb1Fl能協(xié)同IL-4誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化發(fā)育為Mo

14、-DC，并且，McAb1Fl介導(dǎo)的逆向信號(hào)在Mo-DC的形成過(guò)程中起到了類似GM-CSF的作用即促進(jìn)Mo-DC的有效增殖。McAb1Fl促進(jìn)Mo-DC增殖的機(jī)制的初步研究表明，抗體介導(dǎo)的逆向信號(hào)能誘導(dǎo)Mo-DC分泌高水平的細(xì)胞因子M-CSF、GM-CSF和FL，這些細(xì)胞因子的阻斷性抗體均能分別部分阻斷McAb1Fl對(duì)Mo-DC的促增殖效應(yīng)，抗體的聯(lián)合運(yùn)用則可完全阻斷McAb1F1介導(dǎo)的Mo-DC增殖效應(yīng)。 在單核細(xì)胞分化和發(fā)育為

15、Mo-DC的過(guò)程中，4-1BBL逆向信號(hào)還能促進(jìn)Mo-DC的成熟及調(diào)節(jié)Mo-DC的功能，有效地上調(diào)MoDC對(duì)CD86、CD83和MHCII的表達(dá)，下調(diào)CDl4的表達(dá)。4．1BBL逆向信號(hào)還能改變其他膜分子的表達(dá)，如下調(diào)PD-L1的表達(dá)。McAb1Fl協(xié)同IL-4培養(yǎng)的Mo-DC吞噬能力顯著下降，這也表明4．1BBL逆向信號(hào)具有促進(jìn)Mo-DC成熟的作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4．1BBL逆向信號(hào)促進(jìn)TNF．Q、IFN—Y、IL．12和IL-6

16、的分泌及抑制IL一10的分泌，TNF-α、IFN．Y分泌的增加和IL-10分泌的減少可能是4．1BBL逆向信號(hào)促進(jìn)Mo-DC成熟的重要原因。4．1BBL逆向信號(hào)還能促進(jìn)Mo-DC分泌趨化因子MCP．1、MIP-α、MIP-β、MDC及IL-8等，這些趨化因子介導(dǎo)了DC和其他免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞和T細(xì)胞的遷移效應(yīng)。而且采用McAb1Fl協(xié)同IL-4誘導(dǎo)單核細(xì)胞形成的DC激發(fā)T細(xì)胞的功能明顯強(qiáng)于常規(guī)方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的Mo-DC。其機(jī)制可能是4．1

17、BBL逆向信號(hào)誘導(dǎo)的Mo-DC分泌高水平的細(xì)胞因子，上調(diào)表達(dá)CD86、CD83、MHCⅡ及下調(diào)表達(dá)PD-L1分子，通過(guò)這些分子的聯(lián)合作用提高了Mo-DC對(duì)T細(xì)胞共刺激作用。上述研究結(jié)果表明，McAbIFl聯(lián)合IL-4培養(yǎng)的Mo-DC具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，為解決制約DC在腫瘤免疫治療中應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)一獲得大量功能性的DCs--提供了一條新的途徑。 總結(jié)以上研究結(jié)果及國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者的相關(guān)報(bào)道，提出了4．1BB／4—1BBL雙向信號(hào)