調(diào)節(jié)RAGE表達促進內(nèi)皮祖細胞衰老的實驗研究.pdf

1、動脈粥樣硬化是動脈的一種炎性、退行性和增生性病變，其病理生理基礎(chǔ)在于血管損傷后新生內(nèi)膜過度增殖及內(nèi)皮功能不全。EPCs是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細胞，但尚未表達成熟血管內(nèi)皮細胞表型，也未形成血管的前體細胞。EPCs不僅參與血管形成(angiogenesis)，同時也參與出生后血管生成(vasculogenesis)和損傷血管內(nèi)皮功能的修復，在防治動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。骨髓EPC雖屬于早期細胞，其功能和潛質(zhì)仍不可避免的

2、受到遺傳和機體環(huán)境的影響，會出現(xiàn)細胞衰老的表現(xiàn)[1、2]，不僅修復損傷血管內(nèi)膜防治動脈粥樣硬化的能力下降，甚至會導致血管損傷后新生內(nèi)膜過度增殖，內(nèi)皮功能紊亂，促使動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[3，4]。了解影響EPCs衰老因素，明確其影響EPCs活性途徑，提高EPCs功能活性，對防治動脈粥樣硬化將產(chǎn)生積極的影響。 晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子

3、與葡萄糖或其它還原單糖通過非酶糖基化反應(yīng)生成的穩(wěn)定的共價化合物。血清AGEs水平在高齡、動脈粥樣硬化、糖尿病患者中顯著升[5、6]。血清AGEs濃度可作為機體衰老和動脈粥樣硬化早期預測的生物學標志[7-10]。AGEs與內(nèi)皮細胞表面的RAGE結(jié)合能促進氧化應(yīng)激，激活NF-KB，增加血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、組織因子的表達，增加內(nèi)皮細胞的滲透性，減少一氧化氮(NO)合成，促進單核細胞的黏附和經(jīng)內(nèi)皮的遷移，提高促凝活性，促進脂質(zhì)

4、的浸潤[11-14]，這些在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。在我們既往的研究中發(fā)現(xiàn)老齡大鼠的血清可以抑制年輕供體大鼠骨髓EPCs的活性，而使用年輕供體大鼠的血清則可以提高老齡供體大鼠骨髓EPCs活性，說明老齡大鼠血清中某些成分可以抑制EPCs功能。我們也發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化會導致EPCs數(shù)量減少、活性減退，且與動脈粥樣硬化程度正相關(guān)[15]，認為某些和動脈粥樣硬化相關(guān)的物質(zhì)可能影響EPCs功能導致EPCs衰老。Dernbach等[1

5、6]發(fā)現(xiàn)EPCs相對于內(nèi)皮細胞(EC)具有更低的ROS水平，EPCs修復損傷血管的能力與其較低的ROS水平有關(guān)，ROS水平升高，EPCs修復損傷血管的活性降低?；谝陨涎芯课覀冊O(shè)想AGEs通過RAGE調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化應(yīng)激影響EPCs衰老，參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程。 本實驗擬使用使用AGEs交聯(lián)阻斷劑ALT711治療，觀察ALT711治療對不同年齡大鼠骨髓EPCs功能的影響；體外培養(yǎng)骨髓EPCs，驗證AGEs對EPCs生物學功能

6、的影響；調(diào)節(jié)EPCs表面RAGE的表達，研究RAGE表達改變對EPICs衰老的影響。 方法： 1、使用AGEs交聯(lián)阻斷劑ALT711治療，觀察ALT711治療對不同年齡大鼠骨髓EPCs功能的影響：3-4月齡、10-12月齡、18-20月齡SD雄性大鼠，隨機分為ALT711喂養(yǎng)組和對照組，從骨髓獲取單個核細胞并進行體外培養(yǎng)、分化。培養(yǎng)7d后檢測各組EPCs遷移、黏附、增殖能力。提取不同年齡段大鼠血清，分為ALT711干預組

7、和對照組培養(yǎng)年輕大鼠骨髓EPCs，培養(yǎng)7d后檢測培養(yǎng)的各組EPCs遷移、黏附、增殖能力。探討供體年齡因素對骨髓內(nèi)皮祖細胞功能的影響及ALT711對高齡供體骨髓EPCs的活化作用。 2、觀察不同濃度AGEs對EPCs活性的影響：3-4月齡SD雄性大鼠，從骨髓獲取單個核細胞并進行體外培養(yǎng)、分化。培養(yǎng)7d后在EPCs中加入不同濃度AGEs，測定AGEs作用24h后EPCs內(nèi)活性氧、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-

8、PX)含量，同時測定EPCs遷移、黏附、增殖能力。探討AGEs對骨髓EPCs活性的影響。 3、觀察CRP對EPCs活性的影響：3-4月齡SD雄性大鼠，從骨髓獲取單個核細胞并進行體外培養(yǎng)、分化。培養(yǎng)7d后在EPCs中加入不同濃度CRP，測定CRP作用不同時間后EPCs遷移、黏附、增殖能力。探討CRP對骨髓EPCs活性的影響。 4、研究RAGE介導的氧化應(yīng)激對EPCs功能的影響及在EPCs衰老中的作用：使用不同濃度CRP刺激

9、EPCs，檢測CRP對RAGE的上調(diào)作用和對AGEs與RAGE結(jié)合的協(xié)同促進效應(yīng)；使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNA到EPCs，檢測siRNA對RAGE的下調(diào)作用；檢測不同RAGE表達狀態(tài)下EPCs內(nèi)氧化應(yīng)激強弱；使用β半乳糖酐酶染色檢測EPCs衰老狀態(tài)。 5、研究阻斷RAGE表達對頸動脈損傷模型的修復作用：建立頸動脈損傷大鼠切脾模型并隨機分為對照組、高表達RAGE移植組和阻斷RAGE表達組進行細胞移植，于細胞移植后14d，檢測各

10、族頸動脈內(nèi)膜/中膜比、血管張力。 結(jié)果： 1、分離所得的單個核細胞初為圓形，培養(yǎng)3-5天后可觀察到少量梭形貼壁細胞，7-10天后出現(xiàn)大量梭形細胞，并可觀察到梭形細胞首尾相連形成條索狀結(jié)構(gòu)。用DiI-acLDL及FITC-UEA-I對細胞染色后，通過熒光顯微鏡觀察，染色雙陽性細胞(黃色)為正在分化的EPCs。vWF免疫組化染色陽性細胞呈棕黃色； 2、將不同年齡組培養(yǎng)EPCs進行遷移、黏附及增殖功能分析，結(jié)果提示隨供

11、體年齡的增長，骨髓內(nèi)皮祖細胞遷移、黏附、增殖等功能減退(P<0.01)，ALT711治療可部分恢復年齡相關(guān)骨髓EPCs活性；隨大鼠年齡增加其血清對骨髓EPCs活性具有抑制作用，加入ALT711干預可以拮抗這種效應(yīng)。 3、AGEs作用后EPCs內(nèi)活性氧含量明顯增加，超氧化物岐化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶含量減少，EPCs生物學功能明顯減退(P<0.01)。并且這種變化與AGEs濃度成正相關(guān)(P<0.01)。 4、C反

12、應(yīng)蛋白作用后骨髓EPCs遷移、黏附和增殖能力明顯減退。并且C反應(yīng)蛋白的這種作用成時間和濃度依賴性，隨作用時間延長和/或濃度增加，EPCs功能明顯減退(P<0.01)。 5、使用不同濃度CRP刺激EPCs可以上調(diào)EPCs表面RAGE的表達，增強AGEs與RAGE結(jié)合，增強EPCs內(nèi)氧化應(yīng)激，促進EPCs衰老(P<0.01)。使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNA阻斷RAGE可以削弱上訴作用(P<0.01)。 6、不同細胞移植對大

13、鼠頸動脈修復有明顯差異，低RAGE表達組修復頸動脈損傷程度明顯優(yōu)于高RAGE表達組(P<0.01)。 結(jié)論： 1、供體年齡對骨髓EPCs有影響，隨供體年齡增長骨髓EPCs遷移、黏附、增殖等功能減退。ALT711干預可以改善供體增齡導致的EPCs活性減退，拮抗老年供體血清對EPCs活性的負性調(diào)節(jié)效應(yīng)； 2、AGEs促進EPCs內(nèi)活性氧生成，減少抗氧化酶的合成，增強氧化應(yīng)激，破壞細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，使細胞生物學功能受損