FXR激動劑高通量藥物篩選模型的建立及應(yīng)用.pdf

1、本研究為尋找治療心血管疾病以及糖尿病藥物的先導化合物，利用哺乳動物單雜交技術(shù)與高通量篩選技術(shù)在細胞水平上，建立了以FXR為靶點的FXR激動劑的高通量篩選模型，為尋找治療血脂異常疾病藥物的先導化合物開辟了道路。 從肝細胞的總RNA中，利用RT-PCR擴增FXR-LBD基因，將此DNA序列連接到pBind載體上構(gòu)建了融合表達載體pBind-FXR；合成含5個拷貝的GAL4 DNA結(jié)合序列(GAL4RE)并接到pGl3 promote

2、r載體上構(gòu)建了報告載體pGl3-GAL4。通過表達質(zhì)粒和報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染進入細胞，通過測定報告基因熒光素酶的表達，進行FXR的激動劑功能性篩選。 CDCA是FXR的生理激動劑，有較高的激動活性，本研究選用CDCA作為篩選模型的陽性藥。通過對轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，建立起了穩(wěn)定、靈敏，有較高的信噪比的FXR激動劑的高通量篩選模型。在本單雜交模型中，CDCA能明顯提高熒光素酶的表達，并且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性增長，CDCA在

3、50礛時對熒光素酶有最大誘導活性，其倍增數(shù)為12。 本研究還進一步將FXR的篩選模型進行了384孔板的微量化研究，微量化后，F(xiàn)XR激動活性對CDCA仍然呈濃度依賴增長關(guān)系，最大的誘導倍增比96孔板有所下降，為5倍。 應(yīng)用此模型對微生物次生代謝產(chǎn)物庫中的880個樣品以及純化合物庫中的120個樣品進行了篩選，從中得兩個活性化合物CoQl0和F01WA2076A。 CoQ10能明顯提高熒光素酶的表達，并且在一定濃度范圍

4、內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性增長，對熒光素酶的最大誘導倍增數(shù)為5；F01WA2076A也能明顯提高熒光素酶的表達，并且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性增長，對熒光素酶的最大誘導倍增數(shù)可達9以上。 本研究過程中制備了2608株真菌和1840株放線菌的次生代謝產(chǎn)物共8896個樣品，供本模型以及其他模型的篩選。 本研究建立的FXR激動劑的高通量細胞篩選模型以及得到兩個活性化合物CoQ10和F01WA2076A，為FXR相關(guān)疾病的藥物研發(fā)和F