HIF-1α表達(dá)與食管癌細(xì)胞株EC9706凋亡和增殖關(guān)系的研究.pdf

1、背景和目的： 缺氧誘導(dǎo)因子一l(hypoxiainduciblefactor,HIF．1)是存在于哺乳動(dòng)物和人體細(xì)胞內(nèi)的一種介導(dǎo)缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，它普遍存在于人類的多種腫瘤細(xì)胞中，是直接對(duì)氧作出反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。HIF-1是由HIF—lQ和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成的異源二聚體，兩者都是具有bHLH結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-lQ是唯一的氧調(diào)節(jié)亞單位，決定HIF．1的活性。其活性對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新生血管形

2、成以及促進(jìn)腫瘤的增殖生長、侵襲和轉(zhuǎn)移起著重要作用。腫瘤內(nèi)HIF．1的活性取決于HIF．1Q，缺氧及某些癌基因的激活、抑癌基因的失活可使HIF．1Q表達(dá)增加。缺氧是實(shí)體性腫瘤的常見特征，與治療效果差及腫瘤惡性進(jìn)展相關(guān)。在多種惡性腫瘤中都存在HIF．1Q蛋白的過表達(dá)，并與預(yù)后不良密切相關(guān)。一些研究表明，缺氧時(shí)抗凋亡蛋白如Bcl-2被誘導(dǎo)，而促凋亡蛋白如Bax下調(diào)。在誘導(dǎo)凋亡和抗凋亡之間存在著一種復(fù)雜的平衡，HIF．1是此過程的主要調(diào)節(jié)者。有

3、關(guān)HIF．1α、Bcl-2和Bax的表達(dá)與食管癌細(xì)胞凋亡或增殖關(guān)系的研究，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。 食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。盡管在其診斷和治療方面取得了一些進(jìn)步，但是總的治療效果不盡人意。5．氟脲嘧啶(5-FU)作為一種廣譜抗癌藥，已經(jīng)確定為食管癌的主要化療藥物。由于5-FU的廣泛分布，低選擇和各種副作用使其臨床使用受到限制。為了增加療效，減少毒性，5-FU劑量的選擇十分重要。bcl-2基因家族，包括促凋亡基因bax，和抗

4、凋亡基因bcl-2，在凋亡的調(diào)控中起主要作用。而且?guī)缀跛械幕熕幬锒际峭ㄟ^誘導(dǎo)凋亡最終殺死腫瘤細(xì)胞。本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)5-FU誘導(dǎo)的凋亡EC9706細(xì)胞中HIF．1a、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)；MTT法檢測(cè)其抑制率；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡率；光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。本文旨在探討EC9706細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2、Bax與HIF．1Q的相互關(guān)系。以上研究為探索傳統(tǒng)化療藥物5-FU的新機(jī)制，尋找抑制食管

5、癌發(fā)生、進(jìn)展的途徑提供理論依據(jù)。 材料和方法： 食管癌EC9706細(xì)胞由河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。EC9706細(xì)胞培養(yǎng)于普通RPMI．1640培養(yǎng)基中。處理組I至IV分別用含不同濃度(12．5ug／mL、25ug／mL、50ug／mL、l∞ug／mL)5-FU的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)照組正常培養(yǎng)，到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)規(guī)定的72h終止培養(yǎng)，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察處理組與對(duì)照組HIF．1Q、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的

6、變化；MTT法觀察其生長抑制情況；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化及凋亡率。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSSll．O軟件，采用方差分析、x2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，取Q=0．05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果： 1．在EC9706細(xì)胞中，對(duì)照組、處理組I至Iv的HIF．1Q蛋白表達(dá)的陽性率呈逐漸降低趨勢(shì)，其陽性率分別為78．58％、66．50％、50．58％、37％、34．83％。各處理組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；處理組I、I

7、I、IU間的陽性率不同(P<0．05)；處理組III、IV之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。 2．在EC9706細(xì)胞中，對(duì)照組、處理組I至IV的Bcl-2蛋白表達(dá)的陽性率呈逐漸降低趨勢(shì)，其陽性率分別為63．42％、50．67％、43．83％、35．17％、34．67％。各處理組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；處理組I、II、III間的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；處理組III、IV之間的差別無統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義(P>0．05)。 3．在EC9706細(xì)胞中，對(duì)照組、處理組I至IV的Bax蛋白表達(dá)的陽性率呈逐漸升高趨勢(shì)，其陽性率分別為21．17％、32．50％、38．92％、48．93％、50．75％。各處理組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；處理組I、II、III間的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0．05)；處理組III、IV之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。 4．光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，處理

9、組有典型的凋亡形態(tài)，細(xì)胞變小、皺縮、脫落漂浮細(xì)胞增多、細(xì)胞崩解、核固縮，并隨5-FU濃度增高，細(xì)胞碎片依次增多。 5．MTT法測(cè)定5'FU對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制率：對(duì)照組未加5-FU，不受抑制；處理組I至IV分別為49．40％、58．26％、73．01％、77．73％。各處理組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；處理組I、II、III間的抑制率也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；處理組III、IV之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義(P>0．05)。 6．流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：對(duì)照組及處理組I未測(cè)到凋亡細(xì)胞；處理組II、III、IV的凋亡率分別為12．0％、23．2％、22．3％。處理組ⅡI的5-FU濃度治療效果最好，凋亡率最高。 7．5-FU對(duì)細(xì)胞周期的影響表現(xiàn)在：隨著5-FU濃度的增加，G0/Gl期細(xì)胞比例有大致增加的趨勢(shì)。處理組II、III與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P<0．05)；處理組III的G0/G1期細(xì)胞比例升高最明顯，由

11、對(duì)照組的59．1％升為82．0％。處理組IV反而下降為68．1％。5-FU對(duì)處理組I、IV的細(xì)胞周期影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．051。一定濃度的5-FU有G0/Gl期阻滯作用。 結(jié)論： 1．5-FU能明顯抑制EC9706細(xì)胞的增殖，起抑制作用存在量效關(guān)系。 2．5-FU能誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞凋亡并改變其細(xì)胞周期分布，有明顯的G0/Gl期阻滯作用。 3．5-FU治療后使EC9706細(xì)胞的HIF．1Q表達(dá)下降