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文檔簡介
1、前言:
目前,不論是通過外科的、經(jīng)皮的或者經(jīng)內(nèi)窺鏡方式的膽道引流,已經(jīng)成為姑息治療不可切除的惡性低位膽道梗阻的重要手段。特別是微創(chuàng)的經(jīng)皮經(jīng)肝或經(jīng)內(nèi)窺鏡的膽道支架植入,在緩解黃疸癥狀、提高生活質(zhì)量、延長生存期方面起到了積極的作用。然而,術(shù)后腸膽返流所致的支架堵塞和返流性膽管炎卻一直影響著該項治療的實際效果。因此,支架的開通就成為影響生存質(zhì)量和治療費用的重要因素。膽總管末端支架是否跨越壺腹部即Oddi括約肌(sphincter
2、 of Oddi,SO)功能的保留與否,也一直受到爭議。
以往人們大多將研究焦點集中在膽總管末端植入支架后腸膽返流和支架梗阻的相關(guān)因素上,但支架對于SO及膽道壓力的影響機(jī)制還不清楚。而且,膽總管末端支架植入后SO組織結(jié)構(gòu)的變化以及腸膽返流的發(fā)生與程度也鮮有報道。因此,有必要從支架植入后膽道壓力變化、SO組織病理學(xué)改變和腸膽返流的發(fā)生等方面對這些問題進(jìn)行深入的研究。
本研究中,應(yīng)用膽道測壓、膽汁中99mTc-D
3、TPA放射性活度與胰酶含量測定等方法,對動物模型及低位膽道?;颊咧Ъ苤踩肭昂蟮哪懙缐毫εc腸膽返流進(jìn)行對比觀察,并結(jié)合支架植入前后血常規(guī)和血液生化指標(biāo)的變化,探討支架植入后膽道壓力的變化機(jī)制以及腸膽返流與返流性膽管炎的發(fā)生和原因。同時,應(yīng)用VG染色和免疫組化的方法,觀察動物模型膽總管末端支架植入后SO的病理變化,探討一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)和血管活性腸肽(vasoactiveintestinal
4、 peptide,VIP)在SO組織中表達(dá)的變化和意義。從而進(jìn)一步揭示膽總管末端支架植入后膽道壓力和SO功能、組織病理變化的特性和機(jī)制,為腸膽返流所致的支架梗阻和膽道感染等并發(fā)癥的防治開辟新的途徑。
材料與方法:
一、動物模型膽道壓力變化的研究1、實驗動物隨機(jī)選取由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供的健康成年實驗犬6只(雄性4只,雌性2只),年齡2-4歲,體重22.5-30Kg。對實驗犬膽總管末端支架植
5、入前后相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行自身對照比較。
2、儀器和設(shè)備(1)SHIMADZU SDU-500C型超聲診斷儀及SHIMADZU2400(α)DSA設(shè)備。
(2)PC polygram HR高分辨、多通道胃腸功能測定儀及相應(yīng)測壓軟件、三通道測壓導(dǎo)管、低順應(yīng)性水灌注系統(tǒng)。
(3)日立7170A生化分析儀。
3、支架植入
實驗犬在禁食水24小時后,經(jīng)肌肉注射速眠新Ⅱ1.5-3.0m
6、l行全身麻醉。首先在超聲引導(dǎo)下確定膽囊位置,于超聲監(jiān)視下以5.0Fr膽道套管穿刺針經(jīng)皮經(jīng)肝穿刺膽囊,成功后在0.035inch導(dǎo)絲引導(dǎo)下將穿刺針外套管經(jīng)膽囊管送入膽總管內(nèi),并留取膽汁10ml。在加硬導(dǎo)絲引導(dǎo)下,置換5.0Fr20cm動脈鞘于十二指腸內(nèi)。沿動脈鞘插入測壓導(dǎo)管至十二指腸遠(yuǎn)端內(nèi)6-8cm,同時將動脈鞘退至膽總管上端,然后回撤導(dǎo)管測壓。待測壓后,在DSA透視下經(jīng)由動脈鞘于膽總管末端行支架植入,支架為3mm×25mm的編織鎳鈦合金
7、支架(北京安泰公司),其遠(yuǎn)端5-10mm位于十二指腸內(nèi)。抽盡膽囊膽汁,拔除動脈鞘后結(jié)束。術(shù)后給予青霉素160萬U肌注,并繼續(xù)禁食水24小時。5-6周后重復(fù)上述方法穿刺膽囊、留取膽總管膽汁,并插入測壓導(dǎo)管經(jīng)支架內(nèi)送入十二指腸遠(yuǎn)端,回撤導(dǎo)管進(jìn)行測壓。
4、測壓方法
設(shè)置電腦測壓系統(tǒng)參數(shù),水流速度為0.5ml/min,連接測壓導(dǎo)管。待基線平穩(wěn)后,勻速后拽導(dǎo)管經(jīng)由壺腹部至膽總管內(nèi)行測壓并存儲曲線。
二、
8、動物模型SO組織變化的研究1、實驗對象從膽總管末端支架植入前后成功測壓的5只實驗犬中隨機(jī)選取4只,作為病理學(xué)檢查的實驗組。再從中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心隨機(jī)選取健康成年實驗犬3只(雌雄不限,年齡2-4歲,體重22.5-30Kg),作為對照組。
2、藥品和器材(1)一抗:血管活性腸肽抗體,一氧化氮合酶(誘導(dǎo)型)抗體;二抗:山羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。
(2)5%BSA封閉液,SABC
9、,復(fù)合消化液,DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。
(3)C-7070/BX41采集圖像系統(tǒng)(Olympus,JP)。
(4)MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)(Universal Imaging Corporation,USA)。
3、實驗方法
(1)標(biāo)本采集:實驗犬經(jīng)肌肉注射速眠新Ⅱ行全身麻醉。在無菌條件下經(jīng)腹正中切口開腹,并逐層進(jìn)入腹腔。夾閉十二指腸兩端,游離膽總
10、管,將含有支架的膽總管、壺腹部及一部分十二指腸一并取下。分離并留取壺腹部組織,放到4%多聚甲醛內(nèi)固定。
(2)VG特殊染色:標(biāo)本用甲醛浸泡,石蠟包埋,5μm連續(xù)切片;切片常規(guī)用二甲苯脫蠟,經(jīng)各級乙醇后直至流水沖洗2min;蘇木素染色15min,流水沖洗2min;鹽酸乙醇分化10s(提插數(shù)下);流水沖洗30min;VG染液染色5min;小心的用吸水紙將染液洗干,避免磨損組織;乙醇、二甲苯快速的脫水、透明,最后中性樹脂封片固定
11、。
(3)免疫組化:新鮮組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24小時,常規(guī)石蠟包埋,5μm連續(xù)切片,65℃烤25min;常規(guī)脫蠟至水;30%H2O2滅活內(nèi)源性活化酶,浸泡10min后,蒸餾水洗3次;熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01M構(gòu)椽酸鹽緩沖液(PH6.0),微波爐加熱至沸騰后斷電,間隔10min后,反復(fù)2次。冷卻后PBS洗滌2次;滴加5%BSA封閉液,室溫20min。甩去多余液體,不洗;滴加適當(dāng)稀釋的一抗兔IgG,4℃過夜,PBS洗滌
12、;滴加二抗生物素化山羊抗兔IgG,37℃孵育20min,PBS洗;0.05%DAB顯色,鏡下控制反應(yīng)時間,流水沖洗終止反應(yīng);蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,樹脂封片。陰性對照用PBS代替一抗,其余步驟相同。
4、結(jié)果判斷
觀察NOS和VIP時,均以壺腹部SO平滑肌細(xì)胞、粘膜柱狀上皮細(xì)胞和粘膜下結(jié)締組織細(xì)胞的胞核藍(lán)色,胞質(zhì)棕黃色染色為陽性。每張切片選擇5個視野,用40×物鏡觀察采集圖像。對于每張圖像,應(yīng)用MetaM
13、orph和C-7070/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)測定其陽性區(qū)域的積分光密度值(integrated optical density,IOD)。
三、腸膽返流的研究1、受試對象隨機(jī)選取2008年4月至2009年1月間,因惡性低位梗阻性黃疸在中國醫(yī)大附屬盛京醫(yī)院介入病房住院治療的患者16例(男性8例、女性8例),年齡為51-86歲(平均69.63±9.16歲)。其中膽管癌4例、胰頭癌5例、壺腹癌5例、轉(zhuǎn)移癌2例。術(shù)前所有患者沒
14、有膽道感染的臨床癥狀和體征,并排除腸梗阻及腸道手術(shù)病史。所有患者均通過經(jīng)皮經(jīng)肝膽管穿刺的方式,于膽總管末端植入金屬網(wǎng)狀支架。共植入17枚支架(15例各植入1枚,1例植入2枚),直徑為10mm,長度為50-80mm。在植入支架前進(jìn)行血常規(guī)、血液生化檢查和膽汁中胰酶含量的檢測。在支架植入后2-5天(平均3.25±0.86天)進(jìn)行上述各項指標(biāo)和膽汁中放射性活度的檢測。
2、支架植入
患者在超聲引導(dǎo)下,以5.0Fr
15、DLPN膽道穿刺針行經(jīng)皮經(jīng)肝膽道穿刺。成功后,在DSA監(jiān)視下,應(yīng)用導(dǎo)絲引導(dǎo)于梗阻部位近端置入6.0-8.0Fr的外引流管,行單純外引流。待黃疸消退,經(jīng)原有膽道外引流通路于膽道梗阻部位植入金屬網(wǎng)狀支架。并將引流管置于支架近端內(nèi)l-2cm或其上端膽道內(nèi)。術(shù)后2-5天內(nèi)試驗閉管并觀察后,行經(jīng)外引流管的膽道造影確認(rèn),口服核素并留取膽汁后拔管。
3、膽汁中核素的檢測所有患者于造影拔管前禁食一夜。拔管前經(jīng)造影確認(rèn)引流管位置后,口服1m
16、l含有185MBq(5mCi)核素99mTc-DTPA的水,接著250ml溫水漱服,立即平臥位,經(jīng)膽道引流管收集接下來2h的膽汁,取其中的20ml,采用RM905型放射活度檢測儀計數(shù)放射性活度。測量之前測定本底的放射性活度,再測量裝有待測膽汁的注射器內(nèi)的放射性活度,兩者的差值為最終膽汁內(nèi)放射性活度。如果膽汁中可以檢測到放射性活度,則認(rèn)為該患者存在十二指腸膽道返流。
4、膽汁胰酶含量的檢測膽道單純外引流1-2天后,膽汁性狀良
17、好時留取20ml,進(jìn)行支架植入前的膽汁脂肪酶和淀粉酶含量的檢測。支架植入后,于拔管前經(jīng)造影確認(rèn)引流管位置后,留取膽汁20ml行胰酶含量檢測。
5、血常規(guī)和血液生化檢查于膽道穿刺引流前及支架植入后拔管前,分別檢測外周血白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比以及血液生化中總膽紅素和直接膽紅素含量。
四、數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理對實驗所獲得的計量資料結(jié)果,符合正態(tài)分布的,以mean±SD表示,并采用t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行比較;不符合正態(tài)分布
18、的,則計算其中位數(shù)和25%、75%可信區(qū)間,采用Wilcoxon秩和檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異,P<0.01認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。
結(jié)果:
一、動物模型膽道壓力變化的研究1、實驗動物6只實驗犬全部一次穿刺成功,并于測壓后植入支架。其中1只植入支架后5周發(fā)現(xiàn)支架脫落,再次植入支架時因膽汁瘺而死亡;其他5只均于觀察時間內(nèi)再次穿刺、測壓,并健康存活。
2、膽道壓力
19、 膽總管末端支架植入前測得SOBP、CBDP、SOCA、SOD分別為:13.69±4.29mmHg、12.98±2.86mmHg、42.65±8.50mmHg、6.69±1.46s;支架植入5-6周后分別為:10.58±3.98mmHg、7.43±2.20mmHg、31.95±9.00mmHg、4.47±1.21s。其中SOBP和CBDP均高于DP,SOBP較支架植入前有所降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);而CBDP明顯低于支架植入
20、前,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。SOCA較支架植入前降低;SOD相比支架植入前縮短。SOCA和SOD與支架植入前相比,均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
3、腸膽返流
膽總管末端支架植入5-6周后,膽總管膽汁中的脂肪酶和淀粉酶含量分別為9.50±4.80U/L和43.00±6.48U/L,與支架植入前相比均沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
二、動物模型SO組織變化的研究1、VG特殊
21、染色光鏡下觀察(10×物鏡),VG染色后平滑肌呈黃色,膠原纖維和結(jié)締組織呈紅色。膽總管末端植入支架后的實驗組與正常對照組比較,可見SO有以下病理改變:
(1)纖維化:輕度者可見平滑肌中已含有少量膠原和結(jié)締組織纖維。而重度者則可發(fā)現(xiàn)肌肉組織僅呈孤立小島狀,很難發(fā)現(xiàn)肌纖維束,周圍大量膠原纖維和結(jié)締組織,并伴有透明變性。
(2)腺體病變:可見腺體呈囊狀擴(kuò)張,腺肌病變即腺體進(jìn)入平滑肌纖維及膠原纖維組織中被環(huán)繞。
22、> (3)炎性病變:表現(xiàn)為炎性浸潤,即腺體、肌肉和結(jié)締組織間有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。
2、免疫組化
(1)壺腹部SO粘膜層中NOS和VIP的IOD變化:實驗組的NOS和VIP的IOD中位數(shù)分別為18.87和101.18,與對照組相比雖有增加趨勢,但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
(2)壺腹部SO粘膜下層和粘膜肌層中NOS和VIP的IOD變化:實驗組的NOS和VIP的IOD中
23、位數(shù)分別為17.34和45.23,與對照組相比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
(3)壺腹部SO肌層中NOS和VIP的IOD變化:實驗組的NOS和VIP的IOD分別為12.18±5.87和77.85±51.75,與對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
三、腸膽返流的研究1、受試對象16例患者中,支架植入后有1例脫管、1例膽汁未引出而沒有進(jìn)行拔管前膽汁中放射性活度和胰酶含量的檢測;其他14例患者均成功地
24、進(jìn)行了膽汁中放射性活度和胰酶含量的測定。
2、腸膽返流
在14例患者中有85.71%的患者(12/14例)2小時膽汁中檢測到99mTc的放射性活度,所檢測到的放射計數(shù)為3.36±2.82MBq,占總攝入劑量的1.82%。
支架植入前,測得膽汁中脂肪酶和淀粉酶含量的中位數(shù)分別為21.25U/L和10.5U/L。支架植入后,膽汁中脂肪酶和淀粉酶含量明顯升高,其中位數(shù)分別達(dá)到了5902.45U/L和2
25、991U/L,與支架植入前相比均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
3、血常規(guī)和血液生化在14例患者中,支架植入后均沒有出現(xiàn)高熱、寒戰(zhàn)、黃疸加重等膽管炎表現(xiàn)。外周血中的白細(xì)胞計數(shù)為7.59±2.62×109/L,中性粒細(xì)胞百分比的中位數(shù)為73.55%,與支架植入前相比都沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
支架植入前,血液生化中的總膽紅素和直接膽紅素值分別為216.84±138.05umol/L和168.55±
26、103.28umol/L。支架植入后,總膽紅素和直接膽紅素值明顯下降,分別為118.24±91.79umol/L和94.48±68.45umol/L,與支架植入前相比都具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
結(jié)論:
1、動物模型膽總管末端支架植入5-6周后,SO運(yùn)動功能的減弱以緊張性收縮的減弱為主,而基礎(chǔ)性收縮仍然存在。CBDP雖然下降,但仍高于正常的DP,并保持與之的壓力梯度,抑制了腸膽返流的發(fā)生。
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