豬IFIT2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件鑒定.pdf

1、IFITs家族是干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)家族的重要成員，大多數(shù)IFITs基因都由2個(gè)外顯子組成。在正常情況下，細(xì)胞中不表達(dá)IFITs基因，但在干擾素、病毒、微生物的病原相關(guān)分子模式等的刺激下，IFITs基因高效、快速表達(dá)。對IFIT2的研究多是在人和小鼠上進(jìn)行的，目前尚未見有關(guān)豬IFIT2的研究報(bào)告。本課題組在前期的研究中，克隆了豬IFIT2基因并對其啟動子活性區(qū)進(jìn)行了初步分析，

2、發(fā)現(xiàn)-1836～-1661bp和-389～-310bp分別存在著負(fù)調(diào)控元件，-1661～-1397bp和-310～-126bp分別存在著正調(diào)控元件。為了進(jìn)一步確定豬IFIT2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，本研究在生物信息學(xué)預(yù)測的基礎(chǔ)上，采用真核表達(dá)和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，在體外培養(yǎng)的PK15細(xì)胞內(nèi)分析相應(yīng)序列缺失對啟動子活性的影響。得到的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在-1838～-1661bp中存在DeltaEF1元件。

3、在-1661-1579bp中存在1個(gè)ISRE(ISREⅢ)元件。在-389～-310bp中存在Id3結(jié)合位點(diǎn)。在-310～-126 bp中存在2個(gè)ISRE元件（ISREⅠ和ISREⅡ）和2個(gè)NF-kappaB結(jié)合位點(diǎn)(NF-kappaBⅠ和NF-kappaBⅡ)。
　　(2)利用重疊延伸PCR方法對豬IFIT2啟動子區(qū)不同元件進(jìn)行了缺失突變，獲得ΔDeltaEF1、ΔISREⅢ、ΔId3-ttg、ΔId3、ΔISREⅠ、ΔISRE

4、Ⅱ、ΔISREⅠ-Ⅱ、ΔNF-KappaBⅠ、ΔNF-KappaBⅡ、ΔNF-KappaBⅠ-Ⅱ、ΔNF-KappaBⅠ+ISREⅠ-Ⅱ、ΔNF-KappaBⅡ+ISREⅠ-Ⅱ、ΔNF-KappaBⅠ-Ⅱ+ISREⅠ-Ⅱ元件缺失的突變體，并以pGL3-Basic為載體骨架，成功構(gòu)建了熒光報(bào)告基因質(zhì)粒: pGL3-ΔDeltaEF1、pGL3-ΔISREⅢ、pGL3-ΔId3-ttg、pGL3-ΔId3、pGL3-ΔISREⅠ、pGL3-

5、ΔISREⅡ、pGL3-ΔISREⅠ-Ⅱ、pGL3-ΔNF-KappaBⅠ、pGL3-ΔNF-KappaBⅡ、pGL3-ΔNF-KappaBⅠ-Ⅱ、pGL3-ΔNF-KappaBⅠ+ISREⅠ-Ⅱ、pGL3-ΔNF-KappaBⅡ+ISREⅠ-Ⅱ、pGL3-ΔNF-KappaBⅠ-Ⅱ+ISREⅠ-Ⅱ。
　　(3)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析表明，DeltaEF1抑制豬IFIT2基因轉(zhuǎn)錄，NF-kappaBs促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，ISREs是正調(diào)控轉(zhuǎn)