豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構建及豬圓環(huán)病毒2型感染豬肺泡巨噬細胞轉錄組學研究.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea, PED）是一種急性、高度傳播性的腸道疾病，該病由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，以急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水等為主要臨床特征。PED于2010年起在中國再次爆發(fā)，該次流行主要以變異毒株的出現(xiàn)為特征，造成80％-100％的哺乳仔豬發(fā)病，50％-90％的仔豬死亡。后來該病于2013年5月在美國爆發(fā)，給養(yǎng)豬

2、業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失。
　　豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關疾病的重要病原，給當前養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失，其靶細胞主要是單核巨噬細胞系統(tǒng)和樹突狀細胞，其感染后主要的臨床組織病變?yōu)榱馨图毎麥p少和炎性細胞浸潤，最終導致機體免疫功能抑制，從而繼發(fā)感染其他細菌和病毒。
　　本論文針對這兩種豬的重要病原，主要研究內(nèi)容如下:
　　1.PEDV的流行病學調(diào)查通過對2

3、011年2月至2011年10月間從華中、華東、華南、西南地區(qū)12個省份的57個豬場采的455份臨床樣品（包括糞便樣品、小腸樣品和乳汁樣品），用RT-PCR檢測方法檢測，結果顯示，有45個豬場的278份樣品為PEDV陽性，豬場陽性率為78.95％，樣品陽性率為61.11％，這些陽性樣品包括253份糞便樣品、20份小腸樣品、5份乳汁樣品，總樣品陽性率為61.11％，表明PEDV在我國流行十分廣泛，感染率相當高，同時本研究還從乳汁中檢測到PE

4、DV陽性，說明PEDV可能通過母乳垂直傳播給哺乳仔豬。
　　2.PEDV CHGDU株的分離與鑒定盡管PEDV的感染率很高，豬流行性腹瀉病毒的分離仍然十分困難。本研究將采自廣東省某豬場發(fā)病仔豬的小腸樣品處理后，接種Vero-CCL81細胞，同時維持液中添加15μg/mL胰蛋白酶，盲傳3代后，有一份小腸樣品接種的細胞觀察到明顯的PEDV特征性的多核細胞體病變，分離到的病毒通過RT-PCR和IFA檢測，證實PEDV陽性，將該分離株命名

5、為CHGDU。
　　3.PEDV CHGDU株S基因全長測定及分析通過對CHGDU毒株S基因全長測定及分析發(fā)現(xiàn)，該毒株與NCBI中登錄的另一毒株GD-A毒株S基因的序列同源性為100％，進一步分析S基因的序列特征發(fā)現(xiàn)該毒株屬于變異毒株，通過與疫苗株CV777 S蛋白相應區(qū)域分析結果表明:中和表位COE區(qū)域存在3個氨基酸突變（T554S、G599S和Q638S），而另一中和表位S1D區(qū)域包含5個氨基酸的突變(N724S、N728S、

6、P768R、L769S和D771S)，與CV777相比，CHGDU在S1/S2結合位(P768R)和S2'位點突變?yōu)榫彼?G896R)，這些位點可被蛋白質(zhì)轉化酶PC(proprotein convertase，PC)所識別和切割，從而增強病毒致細胞病變的能力和毒力。將CHGDU株的S基因與已測定的其他152株GenBank登錄的S基因全長序列進行比較，并利用MEGA6軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)這些毒株可分為兩個大群即Genogroup1

7、和Genogroup2;其中這兩個群又被分為兩個亞群即1a、1b及2a、2b。Genogroup1群主要由2010年以后分離和報道的中國毒株以及2013年和2014年美國流行毒株組成，其中CHGDU株屬于1a群，屬于PEDV變異株，該毒株與處于2b亞群的疫苗毒株DR13和CV777遺傳關系較遠。
　　4.病毒的S基因全長克隆及重組病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP的拯救為進一步驗證S基因在病毒致病

8、過程中的作用，本研究首先克隆了CHGDU的S基因全長，成功構建表達載體PCAGGS-CHGDU-S-Flag，通過轉染Vero-CCL81，IFA驗證S基因能順利表達，并在5μg/mL胰蛋白酶存在的條件下誘導細胞和細胞的融合，進一步將該基因克隆至穿梭載體，成功構建穿梭載體pPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP，通過體外轉錄RNA，電轉至含有鼠肝炎病毒S基因的重組病毒mPEDV感染的Vero-CCM細胞中，通過定向重組的

9、方法拯救出重組病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP，并且驗證該毒株在培養(yǎng)過程中需要外源添加胰蛋白酶，證明S基因是決定PEDV毒株對胰蛋白酶依賴的關鍵基因。
　　5.Vero-hTMPRSS2-HA細胞系的構建與hTMPRSS2在病毒感染過程中作用的研究首先克隆了人絲氨酸蛋白酶TMPRSS2基因，構建了含有HA標簽的表達質(zhì)粒PQCXIN-hTMPRSS2-HA，Western-blot證實該蛋白正確表

10、達，利用MLV系統(tǒng)，構建穩(wěn)定表達細胞系Vero-hTMPRSS2-HA，并對細胞系進行了IFA和Western-blot檢測hTMPRSS2的表達，證實穩(wěn)定表達hTMPRSS2的細胞系構建成功，再利用含有GFP重組病毒為工具，測定了hTMPRSS2在病毒感染和釋放過程中的作用，結果表明，hTMPRSS2在病毒入侵和釋放過程中均沒有明顯的作用。
　　6.豬圓環(huán)病毒2型感染豬肺泡巨噬細胞的轉錄組學研究本研究采用WH株體外感染豬原代肺泡

11、巨噬細胞，分別在感染后24小時和48小時取樣進行全基因組表達譜分析，結果顯示:24小時感染組中共有266個基因差異表達，其中包括212個上調(diào)表達和54個下調(diào)表達的差異基因;48小時感染組中共有175個基因差異表達，其中包括150個上調(diào)表達和25個下調(diào)表達的差異基因，但兩組間相互比較，僅有6個基因差異表達。24小時感染組差異表達基因主要與細胞的運動、血液系統(tǒng)的形成和功能、免疫細胞運輸、細胞-細胞間的信號傳遞和相互作用和腎臟相關疾病等功能相