樹突狀細胞對口蹄疫病毒VP1-VP4融合蛋白質(zhì)的泛系化作用.pdf

1、口蹄疫(foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMD virus，F(xiàn)MDV)感染偶蹄動物所引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。FMDV共有A、C、O、SAT1、SAT2、SAT3和AsiaⅠ七個血清型，每個血清型又有很多亞型，不同的亞型間幾乎沒有交義免疫原性。
　　FMDV衣殼具有由VP1、VP2、VP3和VP44種結(jié)構(gòu)蛋白組成的正二十面體結(jié)構(gòu)。其中VP1、VP2和VP3是FMDV的主要界面分子，F(xiàn)

2、MDV的主要抗原位點存在于VP1第140～160位氨基酸處的G-H環(huán)上，富含B細胞表位，是四種結(jié)構(gòu)蛋白中刺激機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答最主要的成分，但也是發(fā)生變異的主要區(qū)域，并且只利用VP1的這一個抗原表位作為抗原刺激動物所產(chǎn)生的免疫保護持續(xù)時間很短。除此之外VP1還富含T細胞抗原表位，由O型FMDV的VP1刺激牛所產(chǎn)生的CTL應(yīng)答對其余6種FMDV的攻擊具有保護作用，提示VP1上含有能夠發(fā)揮交叉免疫保護的T細胞表位。VP4雖然位于衣殼內(nèi)部，

3、但也存在著T、B細胞表位，并且氨基酸序列比較保守，多種單體型的MHC均可識別VP4的20-34位氨基酸序列，因此VP4被認為是制備通用型FMD疫苗的首選抗原之一。基于此，我們設(shè)計了VP1-VP4融合蛋白，期望獲得的FMDV抗原不僅能夠有效刺激機體產(chǎn)生更加全面的免疫應(yīng)答（包括體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答），而且對于不同血清型的病毒能夠表現(xiàn)出交叉免疫保護作用。
　　蛋白質(zhì)泛素化現(xiàn)象在細胞內(nèi)廣泛存在，參與許多非常重要的生理功能，其中最早確

4、定的功能是泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解。細胞內(nèi)存在兩條主要的蛋白質(zhì)降解途徑，分別為溶酶體途徑和蛋白酶體途徑。泛素化的不同類型決定了底物蛋白的命運。研究認為，多聚泛素化作用傾向于將底物蛋白運送到蛋白酶體內(nèi)進行降解，其中以K11、K48連接的多聚泛素化為主，單鏈泛素化的蛋白質(zhì)則傾向于由溶酶體降解。樹突狀細胞內(nèi)存在的兩種抗原提呈途徑，MHC-Ⅰ類分子途徑和MHC-Ⅱ類分子途徑均與抗原在細胞內(nèi)的泛素化類型密切相關(guān)，研究FMDV抗原在細胞內(nèi)的泛素化類型用

5、以反應(yīng)其在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運、降解途徑是一種行之有效的方法。
　　本試驗利用FK1、FK2兩種抗體檢測樹突狀細胞對重組FMDV VP1-VP4蛋白的泛素化類型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FMDV重組蛋白VP1-VP4在DCs內(nèi)能夠同時被單鏈、多聚泛素化，但是蛋白被多聚泛素化的水平明顯高于單鏈泛素化水平。比較泛素化蛋白在不同時間點的含量發(fā)現(xiàn)3h和6h泛素化條帶加深，表明被吞入內(nèi)吞小體的VP1-VP4在1h后能夠被轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)基質(zhì)中。為了進一步探索造成此結(jié)果

6、的可能原因，我們采用甘露聚糖競爭性抑制MR的活性，并用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察抗原在細胞內(nèi)的動態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制MR后，BMDCs攝取VP1-VP4融合蛋白的量不僅沒有降低反而升高了，提示MR在BMDCs攝取VP1-VP4蛋白過程中發(fā)揮著負調(diào)控的作用。為了驗證泛素化作用對抗原提呈途徑的影響，試驗采用抑制劑分別阻斷抗原提呈的MHC-Ⅰ分子途徑和抗原提呈的MHC-Ⅱ分子途徑。與不加抑制劑的正常組相比，當(dāng)抑制MHC-Ⅰ分子途徑后15min與

7、30 min細胞內(nèi)內(nèi)吞小體的數(shù)目明顯增多，通過內(nèi)吞小體進入溶酶體的VP1-VP4蛋白的量也明顯增加，至60 min后甚至出現(xiàn)了形態(tài)巨大的溶酶體小泡。表明使用抑制劑阻斷抗原經(jīng)過蛋白酶體途徑的降解，造成經(jīng)由溶酶體降解的抗原量明顯增大。該結(jié)果證明重組FMDV VP1-VP4蛋白能夠通過泛素化-蛋白酶體途徑被細胞降解，BMDCs能夠以交叉提呈途徑來提呈FMDVVP1-VP4抗原。當(dāng)抑制MHC-Ⅱ分子途徑后，BMDCs攝取的VP1-VP4蛋白不能

8、在溶酶體內(nèi)被有效降解，隨著時間的延長細胞內(nèi)內(nèi)吞小體/溶酶體不斷融合數(shù)目增多，形態(tài)變大，VP1-VP4蛋白在細胞內(nèi)隨著時間延長而滯留下來。由此可以證明，F(xiàn)MDV VP1-VP4融合蛋白能夠在溶酶體中被降解，MHC-Ⅱ類分子提呈途徑是BMDCs提呈FMDV VP1-VP4抗原的重要途徑。
　　本次試驗利用western bloting、激光共聚焦熒光顯微鏡成像技術(shù)第一次以直觀的形式將BMDCs加工、提呈FMDV VP1-VP4抗原的途