腸道病毒71型雙中和抗原表位嵌合型人3型腺病毒載體的免疫學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建腸道病毒71型雙中和抗原表位嵌合型人3型腺病毒載體，為人3型腺病毒衣殼嵌合載體的應(yīng)用及基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　以前期構(gòu)建的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒pBRAd△E3GFP-sp70為模板，搭橋PCR擴(kuò)增六鄰體不同超變區(qū)（HVR）同時(shí)嵌入EV71的SP55和SP70兩個(gè)中和表位的六鄰體突變基因片段 hexon-sp55sp70，突變的六鄰體片段克隆入穿梭載體，酶切后與線性化的人3型腺病毒骨

2、架質(zhì)粒 pBRAd△E3GFP共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BJ5183，同源重組獲得陽性重組腺病毒質(zhì)粒 pBRsp70sp55Ad3egf，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定并線性化后轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞拯救重組腺病毒。重組腺病毒經(jīng)大量擴(kuò)增純化后，進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和生長(zhǎng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分析病毒的特性，Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)分析嵌合表位在六鄰體上的表達(dá)及在重組腺病毒粒子表面的暴露情況之后，用重組腺病毒免疫BALB/c小鼠，通過Western blo

3、t，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠的體液免疫反應(yīng)，微量中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗血清體外中和EV71病毒的活性。
　　結(jié)果:
　　在 SP70嵌入六鄰體 HVR1區(qū)的基礎(chǔ)上，SP55嵌入六鄰體HVR4區(qū)和HVR5區(qū)的重組腺病毒質(zhì)粒未能成功拯救出重組病毒，而SP55嵌入HVR2區(qū)成功拯救出重組腺病毒R1R2A3，而且沒有影響病毒的熱穩(wěn)定性和生長(zhǎng)特性。SP55、SP70表位在六鄰體蛋白融合表達(dá)并且暴露在病毒粒子表面。重組腺病毒初次免疫小鼠即誘導(dǎo)

4、出SP55、SP70表位特異性抗體，多次免疫后抗體應(yīng)答加強(qiáng)。重組腺病毒較SP70-GST，SP55-GST融合蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生更高滴度的IgG抗體，并且重組腺病毒免疫的抗血清能夠體外中和EV71病毒感染。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建表達(dá)雙中和抗原表位嵌合型人3型重組腺病毒，免疫小鼠后誘導(dǎo)出表位特異的體液免疫反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)拓寬了六鄰體衣殼蛋白修飾的3型腺病毒作為多個(gè)外源表位展示載體工具的應(yīng)用，為其以后應(yīng)用于雙價(jià)或者多價(jià)疫苗打下