氨基葡甘露聚糖跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運的研究.pdf

1、目的：用苯酚一硫酸法定量葡甘露聚糖(glucomannanGM)，確定葡甘露聚糖溶液的百分比濃度。利用超聲波的空化作用促使葡甘露聚糖的羥基與氨水(Ⅻ3)發(fā)生氨解反應(yīng)以人工合成氨基葡甘露聚糖(aminoglucomannanAGM)并測定其氨基化程度。用熒光胺(fluram)標(biāo)記氨基葡甘露聚糖并探討標(biāo)記的最佳反應(yīng)條件，鑒定反應(yīng)產(chǎn)物(Fluram-AGM)的熒光光譜特征。用熒光胺示蹤氨基葡甘露聚糖的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運，以此探討氨基葡甘露聚糖跨(細(xì)

2、胞)膜轉(zhuǎn)運的能力與機制。 方法：1。定量葡甘露聚糖：取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖配成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入苯酚和濃硫酸，待其和葡萄糖充分反應(yīng)后在490nm處測定相應(yīng)的吸光度(Aabsorbance)，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程；再配制葡甘露聚糖水溶液，離心并用無水乙醇沉淀，再用蒸餾水復(fù)溶、稀釋；然后加入苯酚和濃硫酸，待苯酚和濃硫酸與葡甘露聚糖充分反應(yīng)后，按測定標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度相同的條

3、件測定其吸光度，再根據(jù)測得的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得稀釋后葡甘露聚糖溶液的濃度。2。制備氨基葡甘露聚糖并測定其氨基化程度：取0．21％葡甘露聚糖溶液20ml，加入2ml氨水，利用超聲波使葡甘露聚糖的羥基發(fā)生氨解反應(yīng)，制得氨基葡甘露聚糖；取標(biāo)準(zhǔn)氨基半乳糖(aminogalactose)配成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入過量的熒光胺，在反應(yīng)介質(zhì)的PH值為8、反應(yīng)溫度為50℃的條件下使熒光胺和氨基半乳糖反應(yīng)30分鐘，用熒光分光光度計在最大激發(fā)波長和

4、最大發(fā)射波長處測定反應(yīng)體系的相對熒光強度，以相對熒光強度為縱坐標(biāo)，氨基半乳糖的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程；再取制備的氨基葡甘露聚糖，加入過量的熒光胺，在與上述條件相同的情況下使兩者充分反應(yīng)并測定反應(yīng)體系的相對熒光強度，根據(jù)測得的相對熒光強度及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得氨基己糖的濃度，進(jìn)而求得氨基己糖在氨基葡甘露聚糖中的含量。3。用熒光胺標(biāo)記氨基葡甘露聚糖：在反應(yīng)介質(zhì)的PH值為7、反應(yīng)溫度為50℃的條件下使熒光胺和氨基葡甘

5、露聚糖反應(yīng)30分鐘，用熒光分光光度計測定反應(yīng)產(chǎn)物(Fluram—AGM)的吸收光譜及發(fā)射光譜；再使熒光胺和氨基葡甘露聚糖在不同的條件(反應(yīng)時間、溫度、介質(zhì)的PH值及熒光胺和氨基葡甘露聚糖的克分子比)下反應(yīng)，用熒光分光光度計在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長處測定反應(yīng)體系的相對熒光強度，得出標(biāo)記的最佳反應(yīng)條件。4。熒光胺示蹤氨基葡甘露聚糖的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運：用熒光胺標(biāo)記氨基葡甘露聚糖，將標(biāo)記所得的熒光衍生物與外周血單個核細(xì)胞(peripheralb

6、loodmononuclearcellsPBMC)和HepG2細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱中孵育，然后用熒光顯微鏡(紫光作激發(fā)光)觀察細(xì)胞。 結(jié)果：1。葡甘露聚糖的濃度是0．2l％。2。氨基葡甘露聚糖的氨基化程度是11．2％。3。熒光胺與氨基葡甘露聚糖的最佳反應(yīng)條件是反應(yīng)介質(zhì)(緩沖溶液)的PH值在6．4—8之間；反應(yīng)時間是30分鐘；反應(yīng)溫度是50~C，氨基葡甘露聚糖與熒光胺的克分子比是1：1000。Fluram-AGM的最大激發(fā)波長385