基于代謝組學(xué)的胃癌化療敏感性和毒性預(yù)測(cè).pdf

1、目的： 化療是治療進(jìn)展期胃癌的重要手段,但由于缺少指示化療敏感性和毒性反應(yīng)的標(biāo)志物,胃癌化療的選擇性和針對(duì)性不強(qiáng),使得其療效一直不能令人滿意,化療相關(guān)的毒副作用也難以避免。如果在胃癌化療前,通過某種檢測(cè)方法篩選出對(duì)化療敏感性高的胃癌患者,僅僅針對(duì)這一部分患者進(jìn)行化療,將無(wú)疑大大提高胃癌化療的有效率,改善胃癌患者的預(yù)后。同時(shí),對(duì)于化療不敏感或化療毒性反應(yīng)大的胃癌患者,可以及時(shí)地調(diào)整、更換或補(bǔ)充相應(yīng)的治療方案,使這一部分患者有機(jī)會(huì)接

2、受更加有效的替代方案,或避免化療相關(guān)毒副作用的發(fā)生,提高生活質(zhì)量。同時(shí),這也將節(jié)約大量的醫(yī)療衛(wèi)生資源,具有極其重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。有鑒于此,本研究結(jié)合我國(guó)胃癌高發(fā)的基本國(guó)情,以人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察荷瘤裸鼠對(duì)胃癌基礎(chǔ)化療方案DDP聯(lián)合5-FU(PF方案)的化療敏感性和毒性反應(yīng),通過建立的血漿代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)獲得荷瘤裸鼠的血漿代謝譜,觀察PF方案對(duì)荷瘤裸鼠代謝譜的影響,探討PF方案治療胃癌的機(jī)制,在代謝水平上研究胃癌化

3、療后出現(xiàn)不同化療敏感性和毒性反應(yīng)的原因,篩選可能具有胃癌化療敏感性和毒性指示作用的代謝標(biāo)志物,構(gòu)建基于代謝組學(xué)的胃癌化療敏感性和毒性預(yù)測(cè)模型,探索胃癌的個(gè)體化治療策略。 方法： 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌MKN-45細(xì)胞株接種于BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下。當(dāng)皮下移植瘤生長(zhǎng)至直徑1cm左右時(shí),切取生長(zhǎng)良好的腫瘤組織,剪切成直徑約1.5mm的小塊,接種至另一只裸小鼠皮下,如此傳代5次以充分活化腫瘤細(xì)胞。取裸小鼠108只,以

4、上述傳代5次的皮下移植瘤為瘤源進(jìn)行批量擴(kuò)大造模,觀察成瘤率。待大部分移植瘤體積接近100mm3時(shí),剔除移植瘤生長(zhǎng)不均勻的裸鼠,剩余80只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為PF干預(yù)組60只,NS對(duì)照組20只。剪耳法標(biāo)記每只荷瘤裸鼠。眼眶靜脈叢采血法采集每只荷瘤裸鼠血液150～200μl,離心制備血漿,以備代謝組學(xué)檢測(cè)。采血后第2天正式給藥,PF干預(yù)組予以腹腔注射DDP 4mg/kg,第1天,5-FU 20mg/kg/d,第2～6天。NS對(duì)照組予以腹腔注射N

5、S,10ml/kg/d,第1～6天。密切觀察荷瘤裸鼠給藥后的反應(yīng),并每天測(cè)量每只荷瘤裸鼠的瘤徑大小及體重,繪制腫瘤體積及體重變化曲線。 給藥結(jié)束24小時(shí)后處死所有荷瘤裸鼠,摘除眼球取血,離心留取血漿,以備代謝組學(xué)檢測(cè)。剝離每只荷瘤裸鼠的腫瘤組織稱取瘤重,同時(shí)剪取心、肝、肺、腎等重要臟器,與腫瘤組織一起予以中性福爾馬林固定保存,常規(guī)IE染色法進(jìn)行腫瘤組織及心肝肺腎等重要臟器的組織病理學(xué)檢查。以相對(duì)腫瘤體積作為PF方案化療敏感性的分

6、類標(biāo)準(zhǔn),將PF干預(yù)組劃分為高敏、中敏和低敏3組,比較各組間的化療敏感性差異。以體重下降百分比作為PF方案化療毒性的分類標(biāo)準(zhǔn),將PF干預(yù)組劃分為低毒、中毒和高毒3組,比較各組間的化療毒性差異?？疾霵F方案的化療敏感性與毒性之間是否具有相關(guān)性。 以Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱和Agilent 1200 RRLC/Agilent 6510 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用分析儀為平臺(tái),建立了基于液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)的血漿代

7、謝組學(xué)檢測(cè)方法,并對(duì)色譜的流動(dòng)相條件以及質(zhì)譜的干燥氣流量、干燥氣流溫度、噴霧壓力等實(shí)驗(yàn)條件分別進(jìn)行了優(yōu)化。利用該技術(shù)平臺(tái)對(duì)采集的兩個(gè)批次的血漿樣品進(jìn)行檢測(cè),以獲得荷瘤裸鼠的血漿代謝譜。原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理后,對(duì)得到的多維數(shù)據(jù)集采用主成分分析(PCA)或偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)等特征提取算法,比較PF方案干預(yù)前后以及PF干預(yù)組與NS對(duì)照組的代謝譜差異,探討PF方案對(duì)荷瘤裸鼠代謝譜的影響；比較PF方案干預(yù)后不同化療敏感性和不同

8、毒性亞組間的代謝譜差異,探討PF方案產(chǎn)生不同化療敏感性和毒性反應(yīng)的代謝機(jī)制；比較PF方案干預(yù)前不同化療敏感性和毒性亞組間的代謝譜差異,篩選可能具有PF方案化療敏感性和毒性指示作用的代謝標(biāo)志物。選取對(duì)胃癌化療敏感性以及毒性各組間分類貢獻(xiàn)最顯著的前200個(gè)變量構(gòu)建基于LC/MS血漿代謝組學(xué)的胃癌化療敏感性和毒性預(yù)測(cè)模型。預(yù)測(cè)模型采用k最近鄰法,采用10重交叉驗(yàn)證優(yōu)化得到最近鄰數(shù)后進(jìn)行分類預(yù)測(cè)。分類預(yù)測(cè)采用兩步預(yù)測(cè)。 計(jì)量資料采用-x

9、±s表示,單因素兩均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),多均數(shù)的比較采用方差分析,兩個(gè)連續(xù)變量的相關(guān)分析采用非參數(shù)Spearman相關(guān)分析。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析和作圖采用Microsott Office Excel 2003和SPSS 15.0軟件包。代謝組學(xué)檢測(cè)生成的代謝譜數(shù)據(jù)采用GeneSpring等軟件包進(jìn)行預(yù)處理,多元統(tǒng)計(jì)分析采用MATLAB軟件包。 結(jié)果： 108只荷瘤裸鼠模型全部制作成功,造模1周后成瘤率為

10、100％。造模2周后,大部分荷瘤裸鼠的皮下移植瘤體積接近100mm3左右,剔除移植瘤生長(zhǎng)不均勻的裸鼠后,將剩余的80只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為PF干預(yù)組60只和NS對(duì)照組20只。兩組在腫瘤體積、體重等方面的組間均衡性無(wú)差異。給藥期間,60只PF干預(yù)組荷瘤裸鼠和20只NS對(duì)照組荷瘤裸鼠全部完成相應(yīng)干預(yù)方案的治療。但PF干預(yù)組中有1只荷瘤裸鼠在治療結(jié)束后意外死亡。療效分析顯示PF干預(yù)組較NS對(duì)照組的相對(duì)腫瘤增殖率為59.6％,腫瘤生長(zhǎng)抑制率為41.

11、9％,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),提示PF方案是治療胃癌的有效方案。從PF干預(yù)第3天起,NS對(duì)照組的腫瘤體積和相對(duì)腫瘤體積逐漸大于PF干預(yù)組,而PF干預(yù)組的體重逐漸低于NS對(duì)照組。但不同的荷瘤裸鼠個(gè)體對(duì)PF方案的化療敏感性和毒性反應(yīng)存在很大差異。根據(jù)相對(duì)腫瘤體積的大小,將PF干預(yù)組劃分為高敏組、中敏組和低敏組3組。PF干預(yù)組的相對(duì)腫瘤體積均低于NS對(duì)照組,且隨著化療敏感性的增高,相對(duì)腫瘤體積呈現(xiàn)逐級(jí)下降的趨勢(shì)(P<0.001)。

12、但NS對(duì)照組和PF低敏組之間無(wú)明顯差異(P=0.392),而其它各組間均有明顯差異(P<0.001)。不同組別的腫瘤組織病理學(xué)檢查也表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效應(yīng)梯度趨勢(shì),與各組間的化療敏感性梯度變化一致。根據(jù)體重下降百分比的不同,將PF干預(yù)組劃分為低毒組、中毒組和高毒組3組。PF干預(yù)組的體重下降程度均重于NS對(duì)照組,且隨著毒性的增高,體重下降程度呈現(xiàn)逐級(jí)加重的趨勢(shì)(P<0.001)。但NS對(duì)照組和PF低毒組之間無(wú)明顯差異(P=0.082),而

13、其它各組間均有明顯差異(P<0.001)。不同組別的心肝肺腎等重要臟器的組織病理學(xué)檢查提示,PF方案干預(yù)后心肝肺均未見明顯毒性。但腎臟組織的病理學(xué)檢查結(jié)果提示PF方案的腎毒性呈現(xiàn)較為明顯的梯度趨勢(shì),與各組間的化療毒性梯度變化一致。相關(guān)分析顯示PF方案的化療敏感性與毒性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.619,P<0.001),即化療敏感性越高,毒性反應(yīng)也就越重。 建立了穩(wěn)定可靠的LC/MS血漿代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù),并利用該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)中所采集的兩個(gè)

14、批次的血漿進(jìn)行了檢測(cè)。應(yīng)用PLS-DA等特征提取算法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),我們所建立的血漿代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)能夠很好地反映荷瘤裸鼠微觀代謝的變化以及不同組別之間的代謝譜差異,而且具有非常高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。在此基礎(chǔ)上,數(shù)據(jù)分析的結(jié)果提示PF方案能夠顯著增加荷瘤裸鼠血漿中的硬脂酰甘油磷酸膽堿、油酰甘油磷酸膽堿等膽堿類甘油磷脂的含量,同時(shí)明顯降低苯丙氨酸、谷氨酸丁酰酯等氨基酸組分的含量,這些明顯的代謝變化可能就是PF方案治療胃癌的代謝機(jī)制。PF

15、干預(yù)后不同化療敏感性亞組間存在的差異代謝物與不同毒性亞組間存在的差異代謝物具有很高的相似性,都包括硬脂酰甘油磷酸膽堿、軟脂酰溶血磷脂膽堿、亞油酰甘油磷酸膽堿、油酰甘油磷酸膽堿、亞油酰溶血卵磷脂、甲地孕酮、萘乙酸等。這些共同的代謝物質(zhì)所在的代謝途徑可能是PF方案化療敏感性與毒性反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)的內(nèi)在原因?？赡芫哂蠵F方案化療敏感性及毒性指示作用的代謝標(biāo)志物包括亞油酰溶血卵磷脂、廿碳三烯酰甘油磷酸且日堿、維甲酸、乳糖酶基神經(jīng)鞘氨醇、十七酰甘油磷

16、酸膽堿、依托孕烯、硬脂酰甘油磷酸膽堿、十六酰甘油磷酸膽堿等。選取對(duì)化療敏感性及毒性反應(yīng)的組間分類影響最顯著的200個(gè)代謝物通過k最近鄰法建立胃癌的化療敏感性和化療毒性預(yù)測(cè)模型。其中,胃癌化療敏感性預(yù)測(cè)模型的第一步預(yù)測(cè)正確率為91.7％,第二步預(yù)測(cè)正確率為88.9％,總預(yù)測(cè)正確率為83.3％。胃癌化療毒性預(yù)測(cè)模型的第一步預(yù)測(cè)正確率為91.7％,第二步預(yù)測(cè)正確率為88.9％,總預(yù)測(cè)正確率為84.3％。 結(jié)論： 本研究首次將代

17、謝組學(xué)引入到腫瘤的化療敏感性和毒性預(yù)測(cè)研究中來(lái),建立了穩(wěn)定可靠的基于LC/MS的血漿代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù),發(fā)現(xiàn)PF方案治療胃癌的機(jī)制主要與膽堿類甘油磷脂以及氨基酸的代謝有關(guān),胃癌化療敏感性與毒性反應(yīng)相關(guān)的原因在于它們具有共同的代謝途徑,初步篩選出亞油酰溶血卵磷脂、廿碳三烯酰甘油磷酸膽堿、十七酰甘油磷酸膽堿、硬脂酰甘油磷酸膽堿、十六酰甘油磷酸膽堿等具有胃癌化療敏感性以及毒性指示作用的代謝標(biāo)志物,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了正確率分別為83.3％和84.