日本血吸蟲雌性特異基因的篩選及排泄-分泌抗原的篩選.pdf

1、研究背景：血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。據(jù)世界衛(wèi)生組織專家估計(jì)，目前仍有76個(gè)國家和地區(qū)流行血吸蟲病，有2億人受感染，6億人受威脅。人體血吸蟲病的病原為日本血吸蟲(Schistosoma，aponicum)，埃及血吸蟲(S. haematobium Bilharz)，曼氏血吸蟲(S. mansoni Sambon)．間插血吸蟲(S.intercalatum Fisher)，湄公血吸蟲(S.meko

2、ngi Voge et al )和馬來血吸蟲(S. malayensis Greer et al)。在我國流行的血吸蟲病為日本血吸蟲(中國大陸株)。日本血吸蟲病曾流行于我國南方12個(gè)省(市)、自治區(qū)，至今仍有8個(gè)省127個(gè)縣，至少有2300萬人受血吸蟲病的威脅。盡管血吸蟲病的防治主要依靠化療及殺滅釘螺，但是血吸蟲病的控制并不理想。因而血吸蟲病的研究轉(zhuǎn)向了對血吸蟲基礎(chǔ)原理的研究，尤其是對其基因組的研究。血吸蟲基因組計(jì)劃(Schistoso

3、ma Genome Project，SGP)始創(chuàng)于1992年，“血吸蟲基因發(fā)現(xiàn)計(jì)劃”是SGP的一部分，該計(jì)劃目的是通過對血吸蟲(曼氏血吸蟲和日本血吸蟲)新基因的研究，搜集血吸蟲生理活動(dòng)、耐藥機(jī)制和免疫逃避方面的資料，為找到新的治療藥物和疫苗奠定基礎(chǔ)。盡管血吸蟲病的防治主要依靠藥物治療及殺滅釘螺，但是血吸蟲病的控制卻并不樂觀，其中的原因有：治療藥物的毒性、行政管理的不善、寄生蟲抗藥性等治療上的限制，頻繁的重復(fù)感染，有效疫苗的使用和研制進(jìn)程

4、受到限制及對血吸蟲生物學(xué)知識的了解不夠深入等等。因而在這個(gè)血吸蟲病防治研究的瓶頸期，大規(guī)模地從基因水平了解血吸蟲基本的生物學(xué)、抗藥性機(jī)制、決定免疫逃避機(jī)制的抗原變異等等都是非常重要的。關(guān)于血吸蟲雌性特異性基因方面的研究過去報(bào)道很少，這些基因都是用傳統(tǒng)方法逐個(gè)鑒定的，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且單個(gè)基因的克隆表達(dá)，無法得到基因之間變化的相關(guān)性，因此利用高效的分離、分析技術(shù)研究雌蟲特異基因的表達(dá)，就有重要的意義(如性成熟相關(guān)基因、產(chǎn)卵相關(guān)基因、雌雄合

5、抱信息傳遞相關(guān)基因等等)，對篩選相關(guān)重要功能、闡明其結(jié)構(gòu)與功能，不僅對解讀血吸蟲生長發(fā)育機(jī)理有重要意義，更可為合理的設(shè)計(jì)抗病疫苗或新藥物等提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，有助于開拓防治血吸蟲病的新途徑。本研究擬將抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization SSH)和表達(dá)序列標(biāo)簽(ExpressionSequence Tag，EST)這一有效的技術(shù)方法應(yīng)用于血吸蟲雌性特異基因的篩選。SSH是一種篩選差異

6、表達(dá)基因的技術(shù)，它是以抑制性PCR(suppression PCR)為基礎(chǔ)，將消減雜交(subtractive hybfidization，SH)和cDNA單鏈檢測標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)合為一體，具有假陽性低、敏感性高、速度快、效率高等特點(diǎn)。而EST是一些從基因文庫中隨機(jī)挑取的cDNA短序列(約300bp)，利用已有的數(shù)據(jù)庫搜索進(jìn)行DNA或蛋白質(zhì)的同源性分析，可以鑒定這些基因的起源，從而達(dá)到發(fā)現(xiàn)基因的目的。我們在建立日本血

7、吸蟲雌成蟲扣除雄成蟲消減cDNA文庫的基礎(chǔ)上利用SSH技術(shù)篩選出雌性特異表達(dá)基因，利用EST從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫中篩選雌成蟲特異的cDNA序列，并對其功能進(jìn)行研究。從而找到一些有價(jià)值的性別特異性基因，為血吸蟲病疫苗的研制及防治方法的選擇提供依據(jù)，將對血吸蟲病的防治具有重要的意義。 血吸蟲的排泄一分泌(exretory-secretory，E-S)抗原是血吸蟲童蟲進(jìn)入人體后在生長發(fā)育過程中的排泄分泌產(chǎn)物，包括童蟲、成蟲及雌

8、蟲產(chǎn)出的蟲卵在發(fā)育成熟過程中的排泄分泌物。這些抗原直接與宿主免疫系統(tǒng)接觸，與宿主的抗體形成、免疫調(diào)節(jié)及肉芽腫的形成密切相關(guān)，因而對血吸蟲排泄一分泌抗原進(jìn)行蛋白質(zhì)譜的鑒定研究，不僅可以掌握更多的疫苗及診斷候選分子，還能更全面地了解血吸蟲一宿主的免疫關(guān)系，包括所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)、宿主肉芽腫形成的機(jī)制等等。本研究通過對日本血吸蟲成蟲、成蟲體外產(chǎn)出的蟲卵進(jìn)行體外培養(yǎng)，收集其E-S抗原。雙向凝膠電泳后，切取目標(biāo)蛋白，LC-MS/MS進(jìn)行多肽測序。測

9、得的多肽序列利用NCBI的Blast網(wǎng)站的Blast P及BlastN進(jìn)行同源性搜索，并對血吸蟲不同階段的E-S抗原譜進(jìn)行分析。這是首次對血吸蟲的E-S抗原進(jìn)行系統(tǒng)的蛋白質(zhì)譜鑒定分析的研究。我們還發(fā)現(xiàn)通過體外培養(yǎng)收集E-S抗原具有簡單易行、純度高、不易污染、不受宿主成分的影響等優(yōu)點(diǎn)。目的： 1．發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲雌成蟲特異性基因，通過GenBank數(shù)據(jù)庫的軟件與所有已知基因和蛋白做同源性分析，初步了解這些基因的功能；找到一些與雌蟲的

10、生殖發(fā)育和產(chǎn)卵有關(guān)的基因，并對其功能進(jìn)行驗(yàn)證。 2．本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)對日本血吸蟲的E-S抗原盡可能多地進(jìn)行鑒定和分析，獲得盡可能完善的E-S抗原蛋白質(zhì)譜。為發(fā)現(xiàn)新的疫苗候選分子提供充分的數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。 方法： 1．應(yīng)用Clontech PCR-Select<'TM> cDNA Subtraction Kit構(gòu)建日本血吸蟲雌蟲的消減性cDNA庫。此庫中的cDNA與T載體連接環(huán)化成質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，篩選

11、有插入片段的克隆。 2．隨機(jī)挑選一些陽性克隆提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chainreaction PCR)擴(kuò)出插入片段，瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，然后分別與<'32>p標(biāo)記的雌雄成蟲第一鏈cDNA探針雜交，篩選出含雌蟲特異性的基因片段的質(zhì)粒DNA。 3．將得到的雌性特異性基因用Blast X及Blast N(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/blast/)程序進(jìn)行同

12、源性搜索，對基因的功能進(jìn)行深入的生物信息學(xué)分析。 4．通過對日本血吸蟲成蟲、蟲卵體外培養(yǎng)方法的建立來收集E-S抗原。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建了日本血吸蟲雌蟲的消減cDNA文庫。 2．得到正向消減及反向消減cDNA文庫，斑點(diǎn)雜交篩選出50個(gè)雌蟲特異性表達(dá)的克隆。 3．將隨機(jī)挑選出的50個(gè)與正向消減文庫探針雜交信號值明顯高于與反向消減文庫探針雜交信號值的克隆進(jìn)行測序。測序得到了42個(gè)EST，其中17個(gè)基

13、因與已知日本血吸蟲卵殼蛋白基因高度同源；17個(gè)基因與日本血吸蟲未知基因高度同源、且有一小段與卵殼蛋白基因高度同源；有8個(gè)基因與日本血吸蟲其他未知基因高度同源。 4．成功的進(jìn)行了日本血吸蟲成蟲和蟲卵的體外培養(yǎng)，并獲得了E-S抗原。 結(jié)論： 1．構(gòu)建了雌、雄蟲正向及反向消減cDNA文庫。用抑制性消減雜交技術(shù)(Suppression subtractive hybridization，SSH)篩選了日本血吸蟲雌性特異性