NDV-F的原核表達(dá)及其免疫反應(yīng)性和雞Ii鏈與MHCⅡ的真核共表達(dá).pdf

1、全文分為二部分: 第一部分 NDV-F的原核表達(dá)及其免疫反應(yīng)性 新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)所致疫病雞新城疫(ND)又稱亞洲雞瘟，是禽類的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型癥狀的高度接觸性急性敗血性傳染病，國際獸疫局把ND定為A類傳染病，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)和人類健康。近年來，我國多次出現(xiàn)此疫情，給我國養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成極大的威脅，并導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，尋找一種理想的免疫保護(hù)性抗原用于該病

2、的快速診斷與免疫防治以及加強(qiáng)NDV分子流行病學(xué)的研究具有重要實(shí)際意義。 融合蛋白(Fusion Protein，F(xiàn))是新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)穿入細(xì)胞膜，發(fā)揮致病作用重要的糖蛋白，與病毒的致病性和毒力密切相關(guān)。F蛋白先是以惰性F0的形式合成，當(dāng)它轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體表面時(shí)，被宿主細(xì)胞蛋白酶裂解成F1和F2兩個(gè)亞單位，使病毒具有感染活性。裂解后的活性蛋白一旦到達(dá)細(xì)胞膜表面即可介導(dǎo)感染細(xì)胞與鄰近

3、細(xì)胞的融合，并逐步擴(kuò)大感染范圍。本課題擬對(duì)NDV F48E9株F蛋白為研究對(duì)象，在對(duì)其克隆測序后，構(gòu)建pGEX-4T-1-F重組質(zhì)粒并進(jìn)行原核表達(dá)。旨在從分子水平探討NDV F48E9株F蛋白結(jié)構(gòu)特征，表達(dá)獲得大量F蛋白，為下一步制備NDV單克隆抗體、研究其功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研制NDV基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。 首先，根據(jù)GenBank已知NDV F48E9株F基因序列和原核表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)引

4、物，以含雞新城疫病毒(NDV)強(qiáng)毒F48E9株F基因重組質(zhì)粒pcDNA-F為模板，PCR擴(kuò)增獲得594bp長度的片段，經(jīng)單酶切鑒定，與GenBank中登錄的NDV F48E9株F基因序列含有相同的單酶切位點(diǎn)。 其次，PCR產(chǎn)物分離純化后連接到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的多克隆酶切位點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)粒PCR和EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ雙酶切鑒定，篩選出陽性重組克隆，構(gòu)建成F基因片斷的原核表達(dá)質(zhì)粒，并命名為pGEX-4-T-1-F。將此原

5、核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-F轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)37℃和1.0mmol/L IPTG的誘導(dǎo)，SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到融合表達(dá)，表達(dá)出谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與F的融合蛋白GST-F，且表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。所獲得的融合蛋白分子量分別約為46KD，與預(yù)期結(jié)果相符。 最后，通過優(yōu)化原核表達(dá)條件，確定了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-F的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度，我們

6、用優(yōu)化的原核表達(dá)條件對(duì)含有pGEX-4T-1-F質(zhì)粒的BL21菌進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中使用反復(fù)凍融和超聲方法來裂解誘導(dǎo)表達(dá)菌，獲得了較高濃度的GST-F包涵體蛋白，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，提取了大量的可溶性GST-F原核融合表達(dá)蛋白。Western-Blot免疫印跡分析表明，此融合蛋白能與NDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的抗原性。綜上所述，本研究成功地克隆了雞NDV F48E9株F基因，并進(jìn)行了原核表

7、達(dá)，獲得了大量的GST-F原核融合表達(dá)蛋白，這些都為進(jìn)一步研究雞NDV-F分子免疫學(xué)功能及其應(yīng)用提供了試驗(yàn)材料。這些都為進(jìn)一步制備NDV單克隆抗體、研究其生物學(xué)功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研制NDV基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。 第二部分 雞Ii鏈與MHC Ⅱ的真核共表達(dá) MHC Ⅱ類分子是呈現(xiàn)在免疫系統(tǒng)特定細(xì)胞表面的由α鏈和β鏈非共價(jià)鍵相連組成的一組高度多態(tài)性的跨膜糖蛋白。這些分子提呈經(jīng)過加工的外來抗原給輔助性T細(xì)胞的抗原受

8、體(TCR)，導(dǎo)致輔助性T細(xì)胞激活和分化，從而在誘發(fā)免疫應(yīng)答中起重要的作用。MHC Ⅱ類分子不正常表達(dá)會(huì)引起嚴(yán)重的免疫缺陷疾病。Ii鏈?zhǔn)且环N非多態(tài)性的Ⅱ型跨膜蛋白，作為分子伴侶，在調(diào)節(jié)MHC Ⅱ類分子的表達(dá)和功能方面發(fā)揮重要作用。 首先，根據(jù)GenBank中登錄的雞類MHC Ⅱ的α鏈和β鏈基因及Ii序列與載體pEGFP-C1及pDsRed2-N1的多克隆酶切位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)三對(duì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/α、p

9、GEX-4T-1/β pcDNA3-Ii中擴(kuò)增出編碼雞α鏈(771bp)和β鏈(798bp)以及Ii(672bp)基因片段。將α、β、Ii片段分別連入綠色熒光蛋白載體上，Ii片段連入紅色熒光蛋白載體上，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒GFP-α、GFP-β、GFP-Ii和RFP-Ii。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果表明，所有目的片段均成功插入相應(yīng)的載體上。 其次，由于雞MHC Ⅱ分子及Ii鏈與哺乳動(dòng)物的同源物之間不僅在氨基酸水平上具有很高的同源性，

10、而且在分子結(jié)構(gòu)上很相似，因此它們應(yīng)該與其哺乳動(dòng)物的同源物一樣在外源性抗原提呈中．發(fā)揮重要作用。但是目前還沒有關(guān)于雞MHC Ⅱ分子與Ii鏈之間的相互作用的報(bào)道，在本實(shí)驗(yàn)中，我們將GFP-α、GFP-β融合基因與Ii基因共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，它們之間存在共定位。 最后，我們通過將GFP-α、GFP-β和GFP-Ii同時(shí)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，或者將GFP-α、GFP-β和GFP-Ii 36h分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，36h

11、后裂解細(xì)胞獲得蛋白，再利用免疫印跡法對(duì)三者之間的關(guān)系進(jìn)行探討。結(jié)果表明，GFP-α、GFP-β和GFP-Ii三者共同轉(zhuǎn)染時(shí)分子量均有變化，但是其原因還不清楚。 綜上所述，本研究通過對(duì)雞MHCⅡ的α鏈和β鏈基因及恒定鏈Ii基因的真核構(gòu)建，利用熒光顯微鏡觀察，觀察MHC Ⅱ的α鏈和β鏈基因及Ii基因在293細(xì)胞上的定位，推斷恒定鏈Ii與MHC Ⅱ的α鏈和β鏈在細(xì)胞中可能存在相互作用，為下一步探討MHC Ⅱ與Ii之間的關(guān)系以及恒定鏈參