鼠傷寒沙門氏菌Δcrp、Δcya缺失菌株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性比較研究.pdf

1、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium,S.typhimurium）屬于沙門氏菌屬B群，是一群宿主非特異性腸道致病菌，具有廣泛的宿主譜和致病性，能致各種動(dòng)物及人的副傷寒，常引起人類食物中毒和醫(yī)院內(nèi)感染。在獸醫(yī)、醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生上都具有十分重要意義?；谀退幮院褪称钒踩矫娴目紤]，疫苗接種免疫是本病防控的一個(gè)理想選擇。目前在一些國家已使用鼠傷寒沙門氏菌活疫苗，并取得了一定的效益，但這些疫苗株是經(jīng)化學(xué)誘變法獲得，對其致弱

2、的遺傳背景不清晰，且存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，用此突變株制備疫苗，其質(zhì)量和安全性難以保證。因此，如何獲得安全性好、免疫原性強(qiáng)的活菌疫苗以有效抵抗鼠傷寒沙門氏菌的感染已成為迫在眉睫的問題。
　　cya基因(adenylate cyclase,cya)編碼合成腺苷酸環(huán)化酶，crp基因(cAMP receptor protein,crp)編碼cAMP的受體蛋白，是沙門氏菌的重要毒力調(diào)節(jié)基因。已有研究報(bào)道鼠傷寒沙門氏菌 cya、crp雙基因缺失

3、株的毒力明顯降低，但保留了良好的免疫原性。基于 crp、cya基因的已知序列，本研究運(yùn)用重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)細(xì)菌的等位基因交換技術(shù)獲得鼠傷寒沙門氏菌SL1344株 crp和cya缺失突變菌株，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究。主要研究內(nèi)容有以下幾個(gè)方面：
　　1．鼠傷寒沙門氏菌SL1344株crp、cya基因的克隆分析
　　參照鼠傷寒沙門氏菌LT2株crp、cya基因序列，從鼠傷寒沙門氏菌SL1344株基因組模板中擴(kuò)增出 crp、

4、cya基因，與 GenBank上登錄的鼠傷寒沙門氏菌LT2、傷寒沙門氏菌Ty2和腸炎沙門氏菌p125109的crp、cya基因保持較高的同源性。
　　2．重組自殺性質(zhì)粒pREΔcya的構(gòu)建
　　以鼠傷寒沙門氏菌 SL1344基因組為模板，分別擴(kuò)增 cya上下游片段并將其克隆入自殺性質(zhì)粒 pRE112上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌χ7213細(xì)胞，構(gòu)建含缺失1182 bp的cya基因重組自殺性質(zhì)粒pREΔcya。
　　3．缺失菌株Δcr

5、pSL1344、ΔcyaSL1344的篩選與鑒定
　　以大腸桿菌χ7213(pREΔcrp或 pREΔcya)為供體菌，SL1344為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。利用等位交換技術(shù)兩步法篩選 crp和 cya基因缺失菌株，通過 PCR鑒定和測序證實(shí)缺失菌株ΔcrpSL1344、ΔcyaSL1344構(gòu)建成功。
　　4．缺失菌株ΔcrpSL1344、ΔcyaSL1344生物學(xué)特性比較研究
　　對兩個(gè)缺失菌株的表型、生長特性、耐藥性、

6、遺傳穩(wěn)定性及對雛雞的毒力等生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)缺失菌株之間的表型、生長特性、耐藥性和遺傳穩(wěn)定性沒有明顯差別。與 SL1344相比，兩個(gè)缺失菌株的血清型沒有發(fā)生變化；但均失去了利用麥芽糖、丙三醇和山梨醇等碳源的能力，不能分解H2S，保留了利用鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇的能力，其他常規(guī)生化特性和耐藥性與親本菌株 SL1344一致；并且生長速度明顯緩慢；能夠分別穩(wěn)定遺傳缺失的 crp和 cya基因。雛雞毒力試驗(yàn)表明Δcrp