雞IL-5基因的克隆表達及其重組雞痘病毒的構建.pdf

1、白介素-5（interleukin-5，IL-5)是由 Takatsu于1980年發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫調節(jié)功能的生物活性介質，其能誘導 B細胞的增殖分化，促進成熟的 B細胞分泌 IgM和活化的粘膜 B細胞分泌合成 IgA，并參與調節(jié)嗜酸性粒細胞的活化、增殖和存活時間等作用，故 IL-5在調節(jié)機體免疫功能，尤其是粘膜免疫方面起著十分重要的作用。目前人和多種哺乳動物的 IL-5已經(jīng)得到了較深入的研究，而對禽IL-5的研究則相當滯后，目前僅Ge

2、nBank收錄一個由Stuart avery預測的雞 IL-5序列，至今尚未見禽 IL-5 cDNA成功克隆及其功能研究方面的相關報道。為此，本實驗根據(jù)這條預測的雞IL-5核苷酸序列進行了以下方面的研究：
　　1.成功克隆了雞 IL-5基因 cDNA根據(jù) Stuart avery所預測的雞 IL-5基因序列設計并合成了1對特異性引物，在國內外首次從 ConA激活的雞體內脾臟淋巴細胞中擴增出 IL-5基因 cDNA并對其各種生物信息

3、進行了分析。結果表明：所克隆的雞IL-5基因 cDNA全長381bp，比Stuart avery預測的少30 bp，但整體蛋白編碼框架未受影響，共編碼126個氨基酸，其中N端22個氨基酸為信號肽，成熟肽分子量為12.14 Ku，與哺乳動物的同源性約為25％，而 Stuart avery預測的蛋白與哺乳動物的同源性約為23%。雞IL-5蛋白的4個α螺旋結構的大小和位置與人 IL-5相比基本一致，相似的結構預示雞 IL-5可能執(zhí)行和哺乳動物

4、IL-5相似的功能。
　　2.實現(xiàn)了雞 IL-5基因的原核表達將所擴增的基因克隆至 pET-28a載體構建了雞IL-5原核表達載體并在大腸桿菌Rosetta(DE3)中通過IPTG的誘導成功實現(xiàn)了表達。表達的 IL-5蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化和復性后，得到了純化和復性的雞IL-5蛋白，為進一步研究禽IL-5的生物學功能奠定了良好的基礎。
　　3.制備了雞IL-5多克隆抗體利用純化和復性的雞IL-5原核表達蛋白做為抗原，和弗氏佐

5、劑乳化混合后免疫成年兔，制備了兔抗雞 IL-5多克隆抗體，效價和特異性、敏感性均已達到今后實驗的需要,為禽 IL-5的進一步研究增加了新的物質基礎。
　　4.構建了雞IL-5重組雞痘病毒將雞IL-5全基因連接到雞痘病毒重組質粒pEF-gpt12S上構建了重組質粒 pEF-gpt-IL-5。然后利用脂質體介導的方法將重組質粒和雞痘病毒混合感染雞胚成纖維細胞，利用選擇性培養(yǎng)基篩選重組痘病毒。連續(xù)稀釋純化病毒后，通過PCR和Wester