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1、輪狀病毒(RotavirusRV)是引起兒童重癥腹瀉的最常見(jiàn)病原之一。據(jù)估計(jì),僅2004年輪狀病毒感染引起約527000死亡病例,主要發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。嚴(yán)重地威脅到兒童的健康,由于目前尚無(wú)治療輪狀病毒的特效藥,因此預(yù)防尤為重要。當(dāng)前全球范圍內(nèi)批準(zhǔn)上市的疫苗有三種:?jiǎn)蝺r(jià)人減毒活疫苗(Rotarix)、五價(jià)牛-人重配株疫苗(RotaTeq)和單價(jià)羊株減毒活疫苗(LLR)。然而,因大多數(shù)輪狀病毒疫苗是不同重配疫苗株混合而成的多價(jià)疫苗,因此,其
2、研制、生產(chǎn)和臨床評(píng)價(jià)中各型毒株的特異性體內(nèi)外定量和定性檢測(cè)是疫苗質(zhì)量控制的關(guān)鍵。本文運(yùn)用SPF兔和無(wú)菌兔來(lái)研究輪狀病毒疫苗免疫和感染情況,為新型輪狀病毒疫苗的臨床評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。 第一部分:輪狀病毒LLR減毒活疫苗對(duì)SPF兔和無(wú)菌兔的致病性和免疫原性研究第一部分實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)兔和無(wú)菌兔為動(dòng)物模型,通過(guò)免疫接種單價(jià)羊株輪狀病毒減毒活疫苗,研究檢測(cè)免疫前后有關(guān)指標(biāo)的變化:用ELISA檢測(cè)血清中IgA和IgG的變化來(lái)評(píng)價(jià)接種疫苗后動(dòng)物
3、的體液免疫;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4/CD8比值的變異來(lái)研究接種疫苗后動(dòng)物細(xì)胞免疫的變化;通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物的便樣,觀察是否出現(xiàn)腹瀉癥狀和排出病毒和通過(guò)免疫組化觀察小腸中是否有輪狀病毒來(lái)闡明LLR是否在小腸繁殖-感染小腸。結(jié)果表明:LLR疫苗可以誘導(dǎo)SPF和無(wú)菌兔產(chǎn)生包括體液免疫和細(xì)胞免疫在內(nèi)的RV特異性免疫應(yīng)答;可在小腸復(fù)制但不致病。 第二部分:輪狀病毒VP6基因的表達(dá)第二部分實(shí)驗(yàn)研究了羊株輪狀病毒VP6基因在大腸桿菌中的表達(dá)。
4、通過(guò)用Trizol法從羊株輪狀病毒減毒活疫苗中提取RNA病毒,RT-PCR擴(kuò)增輪狀病毒第6節(jié)段基因全長(zhǎng),與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽(yáng)性克隆。將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增VP6基因,再與載體pET-32a連接構(gòu)建pET-32a-vp6表達(dá)載體,測(cè)序結(jié)果正確,VP6基因在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),Western-blot鑒定證明了表達(dá)產(chǎn)物為RVVP6蛋白。獲得的VP6蛋白抗原用于制備檢測(cè)血清中輪狀病毒IgA的ELISA試劑
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