黃芪甲甙體外抗乙型肝炎病毒的作用.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV）感染會導(dǎo)致慢性乙型肝炎(CHB)的發(fā)生，同時也是引起肝硬化、肝細胞癌的重要相關(guān)因素。據(jù)流行病學(xué)資料顯示，全世界有20多億人為HBV病毒感染者，其中約有4億人為慢性感染者。估計，每年超過50萬人死于HBV感染所導(dǎo)致的肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌。中國是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，約有10％的人口為HBV攜帶者，HBV感染帶來的健康和經(jīng)濟問題已成為憂國憂民的難題。20世紀90年代以來，重組干擾素及核苷類似物藥物的開發(fā)與應(yīng)用，使C

2、HB的治療取得了一定進展，但是這些藥物存在不能完全清除病毒、易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用大及藥價昂貴等一系列問題。因此，迫切需要尋求高效、安全、廉價的抗HBV藥物。近年來，中醫(yī)藥在治療HBV方面顯示出很大潛力?，F(xiàn)已證明，一些中藥單體如：青蒿素、苦參堿和苦參堿脂質(zhì)體、木香烯內(nèi)酯、珍珠草提取物鞣花酸及虎杖提取物白藜蘆醇等在體外試驗中對乙肝病毒均有不同程度的抑制作用。
　　黃芪為豆科多年生草本植物膜莢黃芪和蒙古黃芪的干燥根，含有多糖、黃酮、皂

3、甙、氨基酸和十幾種微量元素等多種成份。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中含有多種抗病毒成份。黃芪甲甙是黃芪皂甙類有效單體成份，有抗炎、抗高血壓、糖尿病和抗病毒等廣泛的藥理作用。但其抗HBV作用的實驗研究未見報道。本研究擬通過觀察黃芪甲甙對體外HBV的作用，以期為黃芪甲甙的進一步開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)，也為我國抗HBV新藥研制提供一些思路。
　　實驗內(nèi)容：
　　實驗一HepG2.2.15細胞株的檢測，HBsAg和HBeAg檢測
　　目的：

4、觀察HepG2.2.15細胞上清液中HBsAg和HBeAg的分泌。
　　方法：培養(yǎng)細胞，設(shè)ELISA試劑盒中陽性對照劑為陽性對照，含血清培養(yǎng)液為陰性對照，第10天、20天、30天的HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液為實驗組。使用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定法）法檢測培養(yǎng)上清中的HBsAg或HBeAg，顯色反應(yīng)完成后選用450nm波長在自動酶標儀上讀取各孔A值。
　　結(jié)果：HepG2.2.15細胞能穩(wěn)定地分泌HBsAg和HBe

5、Ag，且與時間成正相關(guān)。
　　結(jié)論：在本次實驗，HepG2.2.15細胞分泌穩(wěn)定，是良好的體外模型。
　　實驗二黃芪甲甙體外抗乙型肝炎病毒的作用
　　1、藥物對細胞的毒性試驗
　　目的：觀察黃芪甲甙對HepG2.2.15細胞的毒性作用。
　　方法：用不同濃度黃芪甲甙培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，同時，設(shè)濃度為10mg/L、5.0mg/L和1.0mg/L拉米夫定為陽性對照組和僅加細胞培養(yǎng)液的陰性對照組。在第9天，用3-(4

6、,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）比色法檢測藥物對細胞的毒性。
　　結(jié)果：濃度為100mg/L和50mg/L的黃芪甲甙對HepG2.2.15細胞的抑制率分別為50.6％和35.1％,TC50（半數(shù)毒性劑量）為97.4mg/L。拉米夫定在10mg/L～1.0mg/L濃度對細胞的抑制率為10.5％～6.9％。
　　結(jié)論：黃芪甲甙對細胞的毒性作用非常小。拉米夫定在本實驗濃度對細胞生長未見明顯毒性作用。

7、>　　2、HBsAg和HBeAg的測定
　　目的：探討黃芪甲甙對培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用。
　　方法：使用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中的HBsAg或HBeAg。顯色反應(yīng)完成后選用450nm波長在自動酶標儀上讀取各孔A值，計算抗原抑制率。
　　結(jié)果：不同濃度黃芪甲甙和拉米夫定對HBsAg和HBeAg分泌均有一定抑制作用，且隨劑量的增加，治療時間的延長抑制作用也隨之增加。黃芪甲甙給藥6日，其HBsAg和

8、HBeAg的50％抑制濃度（IC50）分別為53.5mg/L和59.4mg/L；給藥9日，其HBsAg和HBeAg的IC50分別為22.1mg/L和26.2mg/L。在第9日，黃芪甲甙的HBsAg和HBeAg治療指數(shù)（TI）分別為4.4和3.7。拉米夫定給藥6日，其HBsAg和HBeAg的抑制率分別為：25.3％～3.5％和39.6％～3.6％；給藥9日，其HBsAg和HBeAg的抑制率分別為：35.2％～2.7％和43％～4.2％。<

9、br>　　結(jié)論：黃芪甲甙和拉米夫定對培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用，且與劑量-時間成正相關(guān)。
　　3、HBVDNA的檢測
　　目的：探討黃芪甲甙對培養(yǎng)上清中HBVDNA分泌的作用。
　　方法：采用熒光定量PCR法分析黃芪甲甙對細胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA含量的影響。
　　結(jié)果：黃芪甲甙和拉米夫定均有一定程度的抗HBVDNA的作用。黃芪甲甙給藥6日，其HBVDNA的IC50為39.9mg/