必需氨基酸調(diào)節(jié)奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的作用機(jī)制.pdf

1、本研究以奶牛乳腺細(xì)胞和組織為模型，研究必需氨基酸比例(Lys與Thr，His和Val的比例)對(duì)乳蛋白和乳脂肪合成的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制，為定向調(diào)控乳蛋白和乳脂肪合成，改善乳品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。
　　1、氨基酸配比對(duì)奶牛乳腺合成乳蛋白的影響
　　1.1、氨基酸配比對(duì)奶牛乳腺合成乳蛋白的影響
　　為了研究氨基酸配比對(duì)mTOR信號(hào)通路和奶牛乳腺合成乳蛋白的影響。本試驗(yàn)采用qPCR和Western-blot方法，測(cè)定了乳蛋白合成信號(hào)

2、通路相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)情況。試驗(yàn)處理為:1）最優(yōu)氨基酸比例(OPAA; Lys∶Met2.9∶1;Thr∶Phe，1.05∶1;Lys∶Thr,1.8∶1;Lys∶His，2.38∶1;Lys∶Val，1.23∶1)加mTOR抑制劑雷帕霉素組(OPAARMC，對(duì)照);2）OPAA;3）2.1∶1 Lys∶Thr(LT2.1);4)1.3∶1 Lys∶Thr(LT1.3);5)3.05∶1 Lys∶His(LH3.0);6)1

3、.62∶1 Lys∶Val(LV1.6)。乳腺細(xì)胞在以上處理中孵育12h。OPAA組上調(diào)了SLC1A5，SLC7A5，RPS6KB1的基因表達(dá)，下調(diào)了IRS1，AKT3，TSC2，EEF1A1和EEF2的基因表達(dá)。LT2.1，LT1.3和LH3.0組均增加了SLC1A5，SLC7A5，SLC2A1，SLC2A8，STAT5B和RPS6KB1的基因表達(dá)，并減少了TSC2和EEF1A1的表達(dá)。LV1.6組與LT2.1，LT1.3和LH3.0

4、組對(duì)SLC1A5，SLC7A5，SLC2A1，SLC2A8，STAT5B和RPS6KB1的基因表達(dá)具有相似的影響。此外，LV1.6組與OPAA和OPAARMC組相比，顯著增加了mTOR的基因表達(dá)。然而，與OPAA組和OPAARMC組相比，LV1.6組上調(diào)了TSC1和TSC2，下調(diào)了EIF4EBP1的基因表達(dá)。與OPAARMC組相比，OPAA和LT1.3組增加了mTOR和S6K1的磷酸化。OPAA，LT1.3，LT2.1，LH3.0，和L

5、V1.6組均顯著增加了rpS6的磷酸化。并且，OPAA組顯著增加了β-酪蛋白的表達(dá)，磷酸化的mTOR，S6K1和rpS6與β-酪蛋白具有顯著的正相關(guān)。因此，OPAA組能夠通過(guò)mTOR信號(hào)通路促進(jìn)乳蛋白的合成。
　　1.2、mTOR信號(hào)通路在氨基酸介導(dǎo)的乳蛋白合成中的作用研究
　　為了深入研究必需氨基酸對(duì)乳蛋白合成信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，本試驗(yàn)檢測(cè)了無(wú)必需氨基酸，添加必需氨基酸和蘇氨酸對(duì)mTOR和乳蛋白的表達(dá)調(diào)控，以及無(wú)必需氨基酸

6、，添加必需氨基酸和蘇氨酸情況下對(duì)S6K1，4EBP1表達(dá)的影響。結(jié)果表明，添加必需氨基酸能顯著增加mTOR和β-酪蛋白的表達(dá)，并且S6K1和4EBP1的表達(dá)也顯著增加。進(jìn)一步添加mTOR的抑制劑雷帕霉素或者通過(guò)mTOR siRNA的方法抑制mTOR的活性，檢測(cè)其對(duì)β-酪蛋白，S6K1，4EBP1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，抑制mTOR活性，無(wú)必需氨基酸，添加必需氨基酸組β-酪蛋白表達(dá)顯著下降，且S6K1，4EBP1的表達(dá)也顯著降低。因此，必需

7、氨基酸可以通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路的方式促進(jìn)乳蛋白的合成，在此過(guò)程中，S6K1，4EBP1是mTOR的直接作用效應(yīng)元件。
　　2、氨基酸配比對(duì)奶牛乳腺合成乳脂肪的影響
　　2.1、氨基酸配比對(duì)奶牛乳腺合成乳脂肪的影響
　　為了研究氨基酸配比對(duì)奶牛乳腺合成乳脂肪的影響。本試驗(yàn)采用qPCR和Western-blot方法，測(cè)定了乳脂肪合成信號(hào)通路相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。試驗(yàn)處理為:1）最優(yōu)氨基酸比例(OPAA;Lys∶

8、Met2.9∶1;Thr∶Phe，1.05∶1;Lys∶Thr,1.8∶1;Lys∶His，2.38∶1;Lys∶Val，1.23∶1)加mTOR抑制劑雷帕霉素組(OPAARMC，對(duì)照);2) OPAA;3)2.1∶1 Lys∶Thr(LT2.1);4)1.3∶1 Lys∶Thr(LT1.3);5)3.05∶1Lys∶His(LH3.0);6)1.62∶1 Lys∶Val(LV1.6)。乳腺細(xì)胞在以上處理中孵育12h。與OPAARMC組

9、相比，LT2.1，LT1.3，LH3.0和LV1.6組顯著上調(diào)了ACSS2，F(xiàn)ABP3，ACACA,FASN,SCD,LPIN1,INSIG1,SREBF1,PPARD和NR1H3的mRNA表達(dá)水平。 LV1.6組顯著上調(diào)了ACSL1，DGAT1，RXRA，下調(diào)了PPARG的mRNA表達(dá)水平。盡管OPAA組對(duì)PPARG沒(méi)有顯著的影響，但是OPAA組顯著增加了ACSS2，F(xiàn)ABP3，ACACA，F(xiàn)ASN，SCD，LPIN1，INSIG1，

10、和SREBF1的mRNA表達(dá)?；蚓W(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，必需氨基酸比例可能通過(guò)SREBF1和PPARG調(diào)節(jié)乳脂肪的合成。因此，必需氨基酸在促進(jìn)脂肪基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)乳脂肪合成方面具有重要作用。
　　2.2、mTOR調(diào)節(jié)氨基酸介導(dǎo)的乳脂肪合成信號(hào)通路。
　　前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)必需氨基酸可以影響乳脂肪合成信號(hào)通路的基因網(wǎng)絡(luò)，為了揭示必需氨基酸對(duì)乳蛋白合成信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，本試驗(yàn)檢測(cè)了無(wú)必需氨基酸，添加必需氨基酸和蘇氨酸對(duì)SREBP1和PPAR

11、G的表達(dá)調(diào)控，以及無(wú)必需氨基酸，添加必需氨基酸和蘇氨酸情況下對(duì)脂肪酸從頭合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因(ACACA，F(xiàn)ASN，F(xiàn)ABP3)和甘油三酯合成相關(guān)基因LPIN1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，添加必需氨基酸能顯著增加轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SREBP1和PPARG的表達(dá)，以及脂肪酸從頭合成關(guān)鍵酶(ACACA和FASN)，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FABP3，以及甘油三酯合成相關(guān)酶LPIN1的mRNA豐度。在必需氨基酸添加的基礎(chǔ)上，抑制mTOR的活性，可以顯著降低PPARG

12、和SREBP1的表達(dá)，同時(shí)，也可顯著降低ACACA，F(xiàn)ASN，F(xiàn)ABP3和LPIN1的表達(dá)。因此，必需氨基酸可以通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路的方式促進(jìn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SREBP1和PPARG的表達(dá)，在此過(guò)程中，ACACA，F(xiàn)ASN，F(xiàn)ABP3和LPIN1可能是mTOR的間接作用效應(yīng)元件。表明必需氨基酸可能通過(guò)mTOR調(diào)節(jié)SREBP1，進(jìn)而在脂肪酸或甘油三酯合成中發(fā)揮作用。
　　綜上所述，最優(yōu)比例的必需氨基酸添加可顯著促進(jìn)乳蛋白的合成。在奶