Piwil2誘導(dǎo)3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　Piwil2屬于Argonaute蛋白家族,是水母、小鼠和人類等不同生物干細(xì)胞自我更新均需要的一類基因。Piwil2在正常人體僅在睪丸和造血干細(xì)胞有表達(dá),但在很多腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株均有表達(dá)。Chen et al證實(shí),腫瘤干細(xì)胞(CSC)和腫瘤干細(xì)胞前體細(xì)胞(pCSC)特異表達(dá)Piwil2蛋白,是干細(xì)胞分裂中的重要的調(diào)控基因,在干細(xì)胞的分化和腫瘤形成和發(fā)展中起著重要的作用,腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞株P(guān)iwil2的陽性表達(dá)

2、是由于pCSC/CSC存在的緣故。我們的研究也顯示,子宮頸癌干細(xì)胞特異表達(dá)Piwil2,且宮頸癌組織也高表達(dá)Piwil2,上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅱ/Ⅲ可見少量表達(dá),而CINⅠ和正常宮頸上皮未見Piwil2表達(dá)。因此,Piwil2作為一種腫瘤睪丸抗原(cancer-testis antigen,CTA),為腫瘤誘導(dǎo)分化治療提供了高度特異的作用靶點(diǎn)。
　　目的：

3、>　　觀察Piwil2對3T3細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用,并深入探討其分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建pIRES2-EGFP-Piwil2真核表達(dá)重組質(zhì)粒。
　　2.利用Lipofectamine2000將pIRES2-EGFP-Piwil2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入3T3細(xì)胞,經(jīng)過G418篩選,建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株3T3-Piwil2細(xì)胞。
　　3.利用細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)觀察Piwil2對3T3細(xì)胞集落形成能力的影響。
　　4.

4、采用細(xì)胞直接計(jì)數(shù)方法觀察Piwil2對3T3細(xì)胞的增殖能力的影響。
　　5.利用FACS技術(shù)分析Piwil2對3T3細(xì)胞周期的調(diào)控作用。
　　6.利用Western blot檢測Piwil2下游相關(guān)基因:stat3\Bcl2\cyclinD1等7.利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),觀察高表達(dá)Piwil2基因后對3T3細(xì)胞成瘤能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-Piwil2真核表達(dá)重組質(zhì)粒。
　

5、　2.建立穩(wěn)定表達(dá)Piwil2基因的3T3-Piwil2細(xì)胞,空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞3T3-EGFP細(xì)胞。
　　3.與3T3-EGFP細(xì)胞相比,高表達(dá)Piwil2基因的3T3-Piwil2細(xì)胞集落形成能力增強(qiáng),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　4.與3T3-EGFP細(xì)胞相比,高表達(dá)Piwil2基因的3T3細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　5.細(xì)胞周期結(jié)果顯示,與3T3-EGFP細(xì)胞相比,3

6、T3-Piwil2細(xì)胞G0/G1期比例下降,S期比例顯著升高,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　6.Western blot結(jié)果顯示了Piwil2的高表達(dá)可以激活Stat3/Bcl-2并且增強(qiáng)Stat/cyclin D1的信號通路。
　　7.3T3-Piwil2細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力增強(qiáng),腫瘤體積顯著大于對照組,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.Piwil2誘導(dǎo)3T3細(xì)胞發(fā)生惡性