HPV18E7抗原HLA—A2限制性CTL表位的初步篩選及鑒定.pdf

1、目的：HPVl8為宮頸癌的第二大病原體,主要與宮頸腺癌相關(guān),由于HPV18E7蛋白是特異性的腫瘤抗原,作為一種理想的靶抗原在免疫治療研究中倍受重視.本研究中,我們通過計(jì)算機(jī)輔助算法來篩選HPV18E7抗原的HLA-A2限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic TLymphocyte,CTL)表位,并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)一步鑒定預(yù)測(cè)的CTL表位能否誘導(dǎo)抗原肽特異性CTL產(chǎn)生,為制備針對(duì)HPV18感染的治療性疫苗提供候選表位. 方

2、法： 1、采用超基序、多項(xiàng)式和量化基序方案相結(jié)合的方法,對(duì)靶抗原HPV18E7的HLA-A2限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè),確定候選的CTL表位. 2、采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案合成多肽,合成的多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析,并用質(zhì)譜進(jìn)行定性鑒定. 3、T2細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn),用合成的抗原肽與TAP缺陷細(xì)胞系T2共孵育,并用PBS作為對(duì)照,用FTFC-鼠抗人HLA-A2單克隆抗體檢測(cè)T2細(xì)胞表面HLA-A2分子的

3、平均熒光強(qiáng)度,來確定合成的抗原肽是否與HLA-A2分子具有親和力. 4、為了鑒定合成的抗原肽的免疫原性,實(shí)驗(yàn)組:用合成的抗原肽負(fù)荷外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)及T2細(xì)胞制備抗原呈遞細(xì)胞:對(duì)照組:采用無關(guān)多肽(}tBVc<,17-28>)負(fù)荷外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)及T2細(xì)胞制備抗原呈遞細(xì)胞.重復(fù)刺激HLA-A2正常健康供者的外周血淋巴細(xì)胞(PBL),1周1次,共3次.分別在第1輪刺激后和第3輪刺激后,采用RPE標(biāo)記的抗原肽特

4、異性五聚體和FTFC標(biāo)記的CD8<'+>單克隆抗體通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗原肽所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原肽特異性CTL的頻率. 結(jié)果： 1、三種方案分別預(yù)測(cè)出5條、1條和6條抗原肽表位,綜合三種預(yù)測(cè)方案預(yù)測(cè)結(jié)果,確定HPVl8E7<,7-15>為候選合成表位. 2、多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析,合成肽的純度大于95﹪,經(jīng)質(zhì)譜分析合成肽的分子量測(cè)定值與理論值相符. 3、存T2細(xì)胞抗原肽結(jié)合試驗(yàn)中,合成的抗原肽能提高

5、T2細(xì)胞表面HLA-A2分子的表達(dá),表明該抗原肽是HLA-A2的配體,能與HLA-A2分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物. 4、在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中,HLA-A2陽性正常供者外周血淋巴細(xì)胞PBL接受抗原肽(HPV18 E7<,7-15>)負(fù)荷自身PBMC的第1輪刺激后,所選淋巴細(xì)胞群中CD8<'+>五聚體<'+>雙陽性的CTI細(xì)胞為1.87﹪,繼續(xù)接受抗原肽HPV18E7<,7-15>負(fù)荷的T2細(xì)胞后2輪刺激,所選淋巴細(xì)胞群中CD8<'+>五聚

6、體<'+>雙陽性的CTL細(xì)胞增至15.73﹪;而對(duì)照組中未檢出抗原肽特異性的CTL細(xì)胞增殖,表明抗原肽HPV18E7<,7-15>能夠誘導(dǎo)正常PBL中特異性CTL的增殖. 結(jié)論： 1、三種預(yù)測(cè)方案聯(lián)合應(yīng)用可提高預(yù)測(cè)效率,避免了在研究HPV18E7抗原表位時(shí)盲目合成多肽. 2、在體外試驗(yàn)中我們鑒定了所合成的高純度抗原肽HPV18E7<,7-15>能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原肽特特性CTL增殖,具有良好的免疫原性.因此抗原肽HP