BRD7蛋白胞漿-胞核移位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能的分子機(jī)制.pdf

1、BRD7是通過(guò)eDNA代表性差異分析方法分離克隆的一個(gè)bromodomain蛋白家族新成員。該基因具有逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞惡性表型，抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，并通過(guò)Ras／MEK／ERK和Rb／E2F兩條通路影響細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞停滯于GO／G1期。同時(shí)發(fā)現(xiàn)BRD7能下調(diào)E2F3啟動(dòng)子活性，分別與核轉(zhuǎn)錄因子IRF2和E1B-AP5發(fā)生交互作用而影響其轉(zhuǎn)錄功能的發(fā)揮，支持BRD7是一個(gè)核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。BRD2是一個(gè)細(xì)胞周期依賴(lài)型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，

2、是通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選到的一個(gè)BRD7交互作用蛋白，并發(fā)現(xiàn)BRD2在鼻咽癌細(xì)胞和活檢組織中表達(dá)明顯下調(diào)，BRD7的重表達(dá)能從mRNA水平上調(diào)BRD2表達(dá)水平，提示BRD7與BRD2蛋白間的交互作用在鼻咽癌的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了十分重要作用。 BRD7作為一個(gè)與鼻咽癌發(fā)病密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄蛋白，本研究一方面探討B(tài)RD7胞漿／胞核移位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及功能；另一方面探討其細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能的分子機(jī)制。 第一部分BRD7核輸入和

3、核輸出功能及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 1．BRD7在不同細(xì)胞系中的亞細(xì)胞定位模式 應(yīng)用綠色熒光蛋白(GFP)介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位方法和Myc靶介導(dǎo)的免疫熒光定位方法，分別考察BRD7在COS7、HeLa和HNEl三種細(xì)胞系中的亞細(xì)胞定位模式。兩種不同的亞細(xì)胞定位方法結(jié)果一致性表明，BRD7均定位于細(xì)胞核，以片狀或條梭狀分布，相對(duì)均勻，沒(méi)有明顯的細(xì)胞類(lèi)型特異性。BRD7在核內(nèi)分布模式同染色質(zhì)的分布存在一定程度的相似性，從側(cè)面支持BRD7是

4、bromodomain蛋白家族的一個(gè)新成員。 2．BRD7核定位信號(hào)的預(yù)測(cè)、分離及功能鑒定 BRD7是一個(gè)潛在的核轉(zhuǎn)錄蛋白，它在胞漿內(nèi)合成后需要一個(gè)進(jìn)入胞核的過(guò)程。在這個(gè)核轉(zhuǎn)位過(guò)程中，一方面依賴(lài)BRD7蛋白本身所固有的核定位信號(hào)(NLS)，另一方面需要其它核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白的協(xié)同參與。通過(guò)WWW：expasy.ch對(duì)BRD7進(jìn)行結(jié)構(gòu)域搜索，發(fā)現(xiàn)BRD7的65-96位氨基酸具有核定位信號(hào)序列(NLS)的特征。通過(guò)GFP介導(dǎo)的

5、亞細(xì)胞定位方法，發(fā)現(xiàn)這個(gè)假定的核定位信號(hào)具有介導(dǎo)異源蛋白GFP胞核定位的功能，是一個(gè)功能性的核定位信號(hào)。通過(guò)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析和功能鑒定，發(fā)現(xiàn)該核定位信號(hào)由三簇堿性氨基酸殘基組成，可區(qū)分成兩個(gè)相互重迭的雙向核靶序列NLS-1和NLS-2，其中NLS-1和NLS-2共用中間一簇堿性氨基酸殘基，并均具有介導(dǎo)異源蛋白GFP胞核定位的功能，可獨(dú)立發(fā)揮核定位信號(hào)功能的作用。通過(guò)構(gòu)建核定位信號(hào)缺失的BRD7突變體，利用GFP介導(dǎo)的直接熒光和Myc靶介

6、導(dǎo)的免疫熒光定位方法，發(fā)現(xiàn)缺失性型BRD7定位在胞漿，發(fā)生了胞漿到胞核的移位障礙。說(shuō)明BRD7的65-96位氨基酸在BRD7的胞核定位模式中發(fā)揮了決定性作用。 3．BRD7核移位障礙對(duì)細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的影響 分別構(gòu)建野生型BRD7和核定位信號(hào)(NLS)缺失型BRD7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HNEl細(xì)胞系。通過(guò)流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)野生型BRD7能阻止細(xì)胞周期GO/GI→S期進(jìn)程，而核定位信號(hào)缺失型BRD7對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制作用明顯降

7、低。E2F3和cyclinDl是細(xì)胞周期Rb/E2F通路中的關(guān)鍵靶分子，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因分析法，發(fā)現(xiàn)野生型BRD7能顯著下調(diào)E2F3啟動(dòng)子活性，而缺失型BRD7對(duì)其啟動(dòng)子活性的負(fù)性調(diào)節(jié)功能明顯減弱。進(jìn)一步通過(guò)Western Blot分析，發(fā)現(xiàn)缺失型BRD7幾乎喪失了對(duì)Rb/E2F通路中關(guān)鍵靶分子E2F3和cyclinDl表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。提示BRD7的胞核分布模式在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮了十分關(guān)鍵的作用。 4．BRD7核輸出信

8、號(hào)的分離與鑒定 核蛋白存在兩種分布模式，即胞核分布和潛在的胞漿分布模式。胞漿/胞核之間的相互穿梭或轉(zhuǎn)位是蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的一種重要方式。核蛋白由胞核向胞漿的輸出需要核輸出信號(hào)序列和其它受體蛋白的協(xié)同參與。為此,本研究探討B(tài)RD7的核輸出信號(hào)序列。首先通過(guò)比較NES databases,并結(jié)合核輸出信號(hào)所具有的一般結(jié)構(gòu):L-x(2,3)-[LIVFM]-x(2,3)-L-x-[LI](X代表任意氨基酸),搜索具有亮氨酸聚集特征的核輸

9、出信號(hào)。發(fā)現(xiàn)BRD7中PL EALN LMR L具有亮氨酸聚集的核輸出信號(hào)特征,但進(jìn)一步功能研究結(jié)果表明,這個(gè)假定的核輸出信號(hào)不具有介導(dǎo)異源蛋白GFP胞漿定位的功能,且其亞細(xì)胞定位或胞漿/胞核分布比例不因?yàn)長(zhǎng)eptomycin B(LMB)的干預(yù)而改變,說(shuō)明pNES不是BRD7的核輸出信號(hào)。 第二部分BRD7的細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能及分子機(jī)制 1.BRD7的細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能 通過(guò)流式細(xì)胞分析,發(fā)現(xiàn)BRD

10、7在鼻咽癌HNE1細(xì)胞中除了存在阻止細(xì)胞周期進(jìn)程的作用外,還具有明顯的細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能。同時(shí)通過(guò)吖啶橙,溴化乙錠(AO/EB)雙色熒光檢測(cè)HNEl細(xì)胞中凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù),進(jìn)一步證實(shí)BRD7具有細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能。說(shuō)明BRD7在抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖過(guò)程中同時(shí)啟動(dòng)了阻止細(xì)胞周期進(jìn)程和促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩架“馬車(chē)”，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞惡性表型的效果。 2．BRD7對(duì)細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵靶分子表達(dá)水平的影響 通過(guò)Wes，tern Blot

11、分析，發(fā)現(xiàn)在BRD7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HNEl細(xì)胞系中，caspase 8和caspase 3的表達(dá)明顯上調(diào)，bc卜2的表達(dá)明顯下調(diào)。說(shuō)明BRD7的過(guò)表達(dá)能夠在蛋白質(zhì)水平上影響Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵靶分子的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。但BRD7參與細(xì)胞凋亡通路的切入點(diǎn)和具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有待進(jìn)一步的闡明。 3．BRD7與BRD2蛋白交互作用的鑒定及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) BRD2是通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到的一個(gè)BRD7潛在交互作

12、用蛋白，為此本研究聯(lián)合應(yīng)用免疫共沉淀、GFP介導(dǎo)的直接熒光和Myc靶介導(dǎo)的免疫熒光定位等方法，一方面進(jìn)一步在哺乳細(xì)胞體系中證實(shí)BRD7和BRD2蛋白間交互作用；另一方面確定其交互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。結(jié)果表明，BRD2的C-末端截短蛋白(aa 428-798)與BRD7全長(zhǎng)蛋白間具有交互作用和共同的亞細(xì)胞定位重迭，支持和證實(shí)了酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 4．BRD2的細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能 BRD2(Ring 3)是一個(gè)細(xì)胞周期依賴(lài)型轉(zhuǎn)

13、錄調(diào)節(jié)因子，具有明顯的蛋白激酶活性。通過(guò)GFP介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位方法和Hochest 33258介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在COS7而是HNEl細(xì)胞中，BRD2均定位于細(xì)胞核，且在核內(nèi)存在兩種分布模式，即彌散分布和點(diǎn)狀分布；BRD2在COS7和HNEl細(xì)胞中均存在明顯的細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能，在COS7細(xì)胞中的凋亡指數(shù)達(dá)到58％±9％，在HNEl細(xì)胞中的凋亡指數(shù)為6％±l％，與空白載體GFP對(duì)照相比存在顯著差異(P<0.05)。非常有趣的

14、是，BRD2在核內(nèi)成點(diǎn)狀分布的細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，提示BRD2的這種點(diǎn)狀分布模式可視為細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)標(biāo)志。同時(shí)將pEGFP-C3／BRD2表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS7和HNEl細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)GFP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)BRD2在COS7和HNEl細(xì)胞中均具有細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能。 5．BRD7與BRD2之間的功能關(guān)聯(lián) 通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因分析，發(fā)現(xiàn)BRD7和BRD2單獨(dú)作用對(duì)TNFα啟動(dòng)子活

15、性沒(méi)有明顯影響，但BRD7和BRD2協(xié)同作用能顯著下調(diào)TNFα啟動(dòng)子活性。說(shuō)明BRD7和BRD2之間協(xié)同作用更進(jìn)一步打破了細(xì)胞凋亡通路中分子之間的平衡，從而反饋性地引起TNFα啟動(dòng)子活性的下降。同時(shí)前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BRD7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HNEl細(xì)胞中，BRD7的過(guò)表達(dá)能夠上調(diào)BRD2的mRNA表達(dá)水平。這些結(jié)果提示BRD7和BRD2之間存在功能上的緊密關(guān)聯(lián)，BRD7可能通過(guò)參與BRD2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路發(fā)揮細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能。 綜

16、上所述，本研究在前期研究確定BRD7為鼻咽癌候選抑瘤基因并定性為一個(gè)潛在的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的基礎(chǔ)上，研究了BRD7在不同腫瘤細(xì)胞系和永生化原代培養(yǎng)細(xì)胞系中的亞細(xì)胞定位；分離和鑒定了BRD7的核定位信號(hào)和核輸出信號(hào)，探討了其胞漿胞核分布模式在細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用；進(jìn)一步證實(shí)了BRD7和BRD2蛋白間的交互作用，初步確定了其交互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；發(fā)現(xiàn)BRD7具有細(xì)胞凋亡始動(dòng)功能，并能影響細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵靶分子bcl-2、cas