大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞β腎上腺素受體胞內(nèi)運輸及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化與調(diào)節(jié).pdf

1、溺海肺損傷包括肺的結(jié)構(gòu)損傷和功能降低。海水淹溺后,引起死亡的主要原因是海水淹溺肺水腫(pulmonary edema of sea water drowning,PE-SWD)。肺微血管內(nèi)皮細胞(microvascular endothelial cells,MVEC)是位于循環(huán)血液與組織液之間的單層扁平上皮細胞,溺海肺損傷時,肺微血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)遭到破壞,使其對液體及溶質(zhì)的通透性增加,造成滲透性肺水腫。因此降低微血管內(nèi)皮細胞的滲透性

2、是治療溺海肺損傷的重要環(huán)節(jié)。
　　 Beta-腎上腺素受體(Beta-adrenergic receptorβ-AR)無論是在病理情況下還是生理情況下,對微血管內(nèi)皮細胞功能和滲透性的調(diào)節(jié)都起著十分重要的作用。Β-腎上腺素受體各個亞型,包括β1-AR,β2-AR和β3-AR,在脈管系統(tǒng)均發(fā)揮一定的作用。許多研究證明,受體激動劑激活β2-AR后可在一定程度上減輕有致炎因子所導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞滲透性的增高,但改變程度有限,臨床效果并不理想

3、。有研究表明這可能與β2-AR在細胞膜的表達水平有關(guān),具體機制不明。最近的研究表明Rab1可調(diào)節(jié)β-AR在細胞膜上的表達,為臨床藥物干預(yù)提供了新的靶點和策略。
　　 β-AR的胞內(nèi)運輸對發(fā)揮其正常功能是十分重要的。Β-AR在細胞表面上表達的水平是受體內(nèi)化、循環(huán)和降解三方面平衡調(diào)節(jié)的結(jié)果。以往的研究也往往集中在受體內(nèi)化、循環(huán)和降解這三個方面,而受體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細胞膜的運輸路徑以及這些路徑對受體功能的影響卻知之甚少。
　　 事

4、實上,受體在細胞器間的運輸是受Rab蛋白調(diào)節(jié)的。Rab蛋白是Ras超家族的一個成員,目前在人類基因組中已證實的有60多種。幾乎所有的Rab蛋白都參與了細胞中囊泡的形成、對接或融合,也參與了細胞的胞吞和胞吐過程。內(nèi)皮細胞主要表達Rab1-9,11,13,14,15,18,22和30。Rab1存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,主要參與蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的順向調(diào)節(jié)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在HEK293T細胞和心肌細胞中,Rab1參于了G蛋白偶聯(lián)受體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向

5、高爾基體運輸?shù)恼{(diào)節(jié),表明Rab1功能的改變可能影響內(nèi)皮細胞表面β-AR的表達,繼而影響細胞的滲透性。
　　 本實驗試通過轉(zhuǎn)染野生型Rab1、Rab1突變體及Rab1小片段RNA觀察β-AR在大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞表面的表達和功能,同時探討Rab1對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞滲透性的影響。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.采用外周肺組織貼塊法培養(yǎng)大鼠RPMVECs,對培養(yǎng)細胞進行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細

6、胞化學(xué)染色鑒定,通過光鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。
　　 2.運用配體飽和測定法測定大鼠RPMVECs海水和LPS處理后、慢病毒包裝的Rab1WT轉(zhuǎn)染后β-AR在胞膜上的表達。
　　 3.運用熒光顯微鏡檢測慢病毒包裝的Rab1WT、Rab1N124I和Rab1siRNA轉(zhuǎn)染PMVEC后β-AR在細胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布狀況。
　　 4.運用Western Blot檢測慢病毒包裝的Rab1WT和Rab1N124

7、I轉(zhuǎn)染PMVEC后pERK1/2的表達情況。
　　 5.運用ELISA方法檢測RPMVECs用海水、LPS處理以及轉(zhuǎn)染Rab1WT后對牛血清白蛋白(BSA)的透過情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.組織塊法培養(yǎng)大鼠RPMVECs的綜合鑒定結(jié)果顯示:組織塊源于外周肺組織,Ⅷ因子相關(guān)抗原和CD34免疫熒光化學(xué)染色陽性,植物凝集素BSI結(jié)合試驗陽性,透射電鏡細胞表面有較多突起,胞漿中有較多吞飲小泡。
　　 2.海水

8、及LPS處理后β-AR在胞膜上的表達明顯降低,轉(zhuǎn)染Rab1WT后可恢復(fù)β-AR在胞膜上的表達。
　　 3.轉(zhuǎn)染Rab1WT后β-AR主要在胞膜上表達,轉(zhuǎn)染Rab1N124I和Rab1siRNA后β-AR主要積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
　　 4.轉(zhuǎn)染Rab1WT后pERK1/2的表達明顯升高,轉(zhuǎn)染Rab1N124I后Rab1WT后pERK1/2的表達明顯降低。
　　 5.海水及LPS處理后對RPMVECs牛血清白蛋白(BSA)