MMP-2、MMP-9對腦出血損傷大鼠實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：腦出血(intracerebralhemorrhage，ICH)后繼發(fā)損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，至今未闡明，近幾年來研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)是導(dǎo)致ICH后繼發(fā)損傷重要因素，能促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，加重腦水腫，使神經(jīng)功能缺失加重。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠ICH后基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmeta

2、lloproteinase，MMP-9)蛋白動態(tài)表達(dá)及其與血腫周圍腦組織含水量的關(guān)系，和觀察七葉皂苷鈉對MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響，探討MMP-2、MMP-9在ICH的損傷機(jī)制，進(jìn)一步了解ICH后繼發(fā)損傷的病理生理過程，為治療ICH提供理論依據(jù)。 方法：將雌雄各半Wistar大鼠250只隨機(jī)分為4組：正常對照組、假手術(shù)組、ICH組和七葉皂苷鈉治療組。每組均觀察手術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、120h、7d、15

3、d八個時間點(diǎn)各觀察指標(biāo)的改變，每個時間點(diǎn)10只大鼠。治療組模型：按照50mg/kg.d七葉皂苷鈉在各時間點(diǎn)向大鼠ICH腹腔注射。ICH組模型：采用立體定向儀把自體血注入大鼠右側(cè)尾狀核制作大鼠ICH動物模型。假手術(shù)組模型：手術(shù)操作程序與ICH組相同，但尾狀核不注入自體血，針留置約10分鐘。正常對照組模型：大鼠不進(jìn)行手術(shù)。在術(shù)后2h進(jìn)行模型成功評價，分別于術(shù)后6h、12h、24h、48h、72h、120h、7d、15d進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評分。

4、在術(shù)后各相應(yīng)時間點(diǎn)取5只大鼠灌注固定后取材作腦片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和HE染色，觀察MMP-2、MMP-9蛋白動態(tài)表達(dá)。根據(jù)顯色的強(qiáng)弱，將免疫組織化學(xué)的結(jié)果分為4級：(一)為陰性，(+)為弱陽性，(++)為中等陽性，(+++)為強(qiáng)陽性。取連續(xù)組織切片在同一強(qiáng)度及放大倍數(shù)觀察，采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法。每只大鼠每個指標(biāo)選一張腦切片，在400倍光鏡下隨機(jī)選測血腫周圍的4個互不重疊的視野，每個時點(diǎn)共計(jì)20個視野，計(jì)數(shù)每個視野的該指標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)，取

5、均數(shù)為各時點(diǎn)該指標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)。另取5只大鼠在術(shù)后各相應(yīng)時間點(diǎn)斷頭取腦組織，用干濕重法測定血腫周邊腦組織含水量。 結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)過程中36只大鼠死亡，ICH組和治療組有15只大鼠手術(shù)后模型評價為0級，手術(shù)成功率84.75％。ICH組在6h～120h的神經(jīng)功能評分與正常對照組、假手術(shù)組、治療組比較，神經(jīng)功能評分下降，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。在ICH組，24h～48h神經(jīng)功能評分顯著降低，在48

6、h神經(jīng)功能評分與24h相比，差異無顯著性(P=0.51)，與其它各時點(diǎn)相比，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000)；ICH組在6h～72h腦組織含水量與正常對照組、假手術(shù)組、治療組比較，血腫周圍腦組織含水量升高，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000,P=0.000)；在ICH組，24h～48h血腫周圍腦組織含水量達(dá)高峰，在48h血腫周圍腦組織含水量與24

7、h相比，差異無顯著性(P=0.16)，與其它各時點(diǎn)相比，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000)；ICH組各時間點(diǎn)MMP-2蛋白表達(dá)與正常對照組、假手術(shù)組、治療組比較，MMP-2蛋白表達(dá)升高，差異具有顯著性(P=0.000,P=0.000，P=0.000)；在ICH組，MMP-2蛋白表達(dá)在6h達(dá)到高峰，與其它各時間點(diǎn)相比較，差異具有顯著性(P=0.000;P=0.0

8、00，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000)；ICH組各時間點(diǎn)MMP-9蛋白表達(dá)與正常對照組、假手術(shù)組、治療組比較，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000)；在ICH組，MMP-9蛋白表達(dá)在24h～48h達(dá)高峰，在24hMMP-9蛋白表達(dá)與48h相比，差異無顯著性(P=0.119)，與其它各時間點(diǎn)比較，差異具有顯著性(P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0

9、.000，P=0.000，P=0.000)；在假手術(shù)組，MMP-2蛋白表達(dá)與血腫周圍腦組織含水量無相關(guān)性(r=0.135，P=0.751)，MMP-9蛋白表達(dá)與血腫周圍腦組織含水量無相關(guān)性(r=-0.433，P=0.284)，MMP-2蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.505，P=0.202)。在ICH組，MMP-2蛋白表達(dá)與血腫周圍腦組織含水量無相關(guān)性(r=-0.009，P=0.983)，MMP-9蛋白表達(dá)與血腫周圍腦組

10、織含水量有相關(guān)性(r=0.949，P=0.000)，MMP-2蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)無相關(guān)性(r=0.038，P=0.928)。在治療組，MMP-2蛋白表達(dá)與血腫周圍腦組織含水量無相關(guān)性(r=-0.434，P=0.284)，MMP-9蛋白表達(dá)與血腫周圍腦組織含水量有相關(guān)性(r=0.907,P=0.002)，MMP-2蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.076，P=0.858)。HE染色：正常對照組、假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)

11、構(gòu)完整，各層細(xì)胞排列整齊，無腫脹。ICH組大鼠腦組織在注血后6h可見血腫周圍散在中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤；24h可見神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，排列紊亂，神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞輕度腫脹，大量中性粒細(xì)胞浸潤；48h血腫周圍細(xì)胞腫脹明顯，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，出現(xiàn)大量泡沫細(xì)胞，組織疏松明顯，表現(xiàn)重度水腫；120h軟化區(qū)組織疏松減輕，小膠質(zhì)細(xì)胞增生，可見少許新生毛細(xì)血管。七葉皂苷鈉治療后與上述病理改變有不同程度的改善。 結(jié)論：自體血制作大鼠ICH動物模

12、型，制作方法簡單，易于操作，與人腦出血病理生理變化基本一致，可作廣泛使用ICH動物模型。ICH后大鼠腦組織內(nèi)MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)增加及腦組織含水量增多，說明MMP-2、MMP-9參與了BBB的損傷，加重腦水腫。MMP-2的蛋白表達(dá)在6h達(dá)高峰，以后逐漸下降，說明MMP-2主要在早期參與BBB的損害，促進(jìn)腦水腫的形成；MMP-9蛋白表達(dá)開始在6h上升，24h～48h達(dá)高峰，以后逐漸下降，說明MMP-9主要在中、晚期參與BBB的