河蜆貝殼粉對小鼠酒精性脂肪肝形成的抑制作用及相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制初步探討.pdf

1、近年來，隨著人們生活水平的提高以及生活習(xí)慣的改變，酗酒人數(shù)不斷增多，酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因。長期重度飲酒者中，90％以上有一定程度的脂肪肝。脂肪肝的最早表現(xiàn)是脂肪變性，同時(shí)伴隨脂質(zhì)代謝紊亂，如甘油三酯（Triglyceride，TC）的合成增加、脂肪輸出減少以及肝外脂肪動員等。目前，關(guān)于酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver，AFL)的免疫學(xué)機(jī)制研究備受關(guān)注，但是具體相關(guān)機(jī)制有待闡明。在AFL患

2、者中，酒精通過各種途徑導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能異常、氧化應(yīng)激、脂肪組織的蓄積和腸道菌群的過度繁殖，進(jìn)而刺激炎性細(xì)胞并釋放各種炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)等，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及肝臟炎性反應(yīng)。目前關(guān)于酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver，AFL)的治療關(guān)鍵是戒酒。去除酒精影響因素后，脂肪變性可恢復(fù)正常。若防治不當(dāng)，在脂肪出現(xiàn)異常變化過程中發(fā)生的脂質(zhì)代謝紊亂可使肝

3、細(xì)胞遭受損害。隨著肝內(nèi)脂肪堆積的增多，肝細(xì)胞損害也隨之加重，肝臟罹患相關(guān)性疾病的風(fēng)險(xiǎn)就越高。所以，抑制AFL的形成對于防治肝臟疾病至關(guān)重要。河蜆盛產(chǎn)于日本北部本州青森縣。當(dāng)?shù)鼐用耖L期食用高溫煅燒后的河蜆殼粉(Fired Shell Powder, FSP)作為一種民間醫(yī)藥治療肝臟疾病。最近，日本學(xué)者Sasaki等研究發(fā)現(xiàn)500℃高溫煅燒下提取的FSP能夠明顯改善急性肝炎模型大鼠的肝功能，并且能通過增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性來促進(jìn)肝臟的炎癥吸收

4、。關(guān)于FSP是否能夠抑制酒精性脂肪肝的形成及其相關(guān)機(jī)制有待闡明。為此，本實(shí)驗(yàn)通過AFL模型小鼠，觀察經(jīng)FSP處理后，小鼠體內(nèi)血脂、肝功能、肝組織內(nèi)TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)水平及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-a、IL-6和IL-10的含量的變化等情況，為證實(shí)FSP能夠抑制AFL的形成及其相關(guān)機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑
　　 6～8W清潔級雌性C57BL/

5、6小鼠，購于上海中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。
　　 煅燒的貝殼粉（由日本弘前大學(xué)SASAKI教授惠贈），RPMI-1640培養(yǎng)液，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，0.01M PBS緩沖液，紅細(xì)胞裂解液，四甲基偶氮唑鹽，胰蛋白酶，TNF-a、IL-6和IL-10ELISA試劑盒，RNA LA PCRrM Kit Ver.1.1等。
　　 2、實(shí)驗(yàn)動物分組及處理
　　 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分成3組：正常對照組(Controlgroup

6、)8只，AFL組和AFL+FSP組各10只。AFL+FSP組每天上午9:00每只小鼠灌胃FSP懸液0.5ml，正常對照組和AFL組同法給予等量雙蒸水；灌胃30min以后，AFL組和AFL+FSP組每只小鼠腹腔注射10％乙醇溶液1ml，正常對照組腹腔注射1ml生理鹽水；連續(xù)處理14天。
　　 3、樣品的采集與指標(biāo)檢測
　　 (1)血脂四項(xiàng)及肝功能的檢測末次處理的次日，眼球取血，離心收集血清。利用全自動化分析儀測定小鼠血清總

7、膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDLC)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic pyruv

8、ic transaminase，GPT)和總膽紅素(Total bilirubin，TBil)的產(chǎn)生水平。
　　 (2)肝組織形態(tài)學(xué)觀察迅速摘取小鼠肝臟，于肝右葉剪取0.5cm×0.5cm大小肝組織，4％多聚甲醛固定48h，制作石蠟切片。HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。
　　 (3)肝細(xì)胞懸液的制備及肝細(xì)胞存活率的測定通過胰蛋白酶冷消化法分離提取肝細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107／ml。以1×106/ml濃度接

9、種細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)至不同時(shí)間點(diǎn)，利用MTS試劑盒測定各細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的OD492值，并計(jì)算肝細(xì)胞存活率。
　　 (4)脾細(xì)胞分離及其懸液制備頸椎脫位處死小鼠，常規(guī)無菌制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107／ml。
　　 (5)實(shí)時(shí)熒光定量(RealTime)PCR技術(shù)檢測法檢測肝組織內(nèi)TNF-a、IL-6和IL-10mRNA的表達(dá)水平。
　　 (6)雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-

10、a、IL-6和IL-10的分泌水平，酶標(biāo)儀測定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 Ls軟件分析，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 (7)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件分析結(jié)果，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、FSP對實(shí)驗(yàn)小鼠血脂的影響
　　 FSP處理C57BL/6小

11、鼠后，小鼠血清中血脂的產(chǎn)生水平結(jié)果為：AFL組血清中TG、TC、HDLC和LDLC的水平均顯著高于正常對照組(P值分別為＜0.01和＜0.05)。AFL+FSP組與AFL組比較，血清中TG和TC的水平顯著下降(P＜0.05);HDLC水平下降，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LDLC的水平則顯示升高(P＜0.05)。AFL+FSP組血清中HDLC的仍顯著高于正常對照組(P＜0.05)。
　　 2、FSP對小鼠肝功能的影響
　　 FSP

12、處理C57BL/6小鼠后，小鼠血清中肝功能的檢測結(jié)果為：用FSP處理C57BL/6小鼠后，小鼠血清肝功能的檢測結(jié)果為：AFL組血清中GOT、GPT和TBil水平均顯著高于正常對照組(P值均＜0.01)。AFL+FSP組血清中GOT和GPT的水平較AFL組顯著下降(P值分別為＜0.05和＜0.01)，但仍顯著高于正常對照組(P值分別為＜0.05和＜0.01);TBil的水平不僅明顯低于AFL組(P＜0.01)，而且基本降至正常對照組水平(

13、P＞0.05)。
　　 3、FSP對小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響
　　 組織切片HE染色可見，對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列規(guī)則成條索狀，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，肝細(xì)胞胞漿均勻，偏嗜酸性；AFL組小鼠肝小葉界限不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，胞漿內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的微小脂滴空泡（脂肪變性）；AFL+FSP組的肝細(xì)胞排列較整齊，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴較少，脂肪變性比AFL組明顯減輕。
　　 4、FSP對小鼠肝細(xì)胞存活率的影

14、響
　　 利用MTS檢測試劑盒測定各組肝細(xì)胞的存活率，從細(xì)胞培養(yǎng)至第6小時(shí)開始，每隔12小時(shí)作為一個(gè)細(xì)胞存活率的檢測時(shí)間點(diǎn)，結(jié)果顯示在84h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)AFL+FSP組肝細(xì)胞存活率均高于AFL組。在此之后細(xì)胞存活率開始下降，提示在一定時(shí)間內(nèi)FSP具有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和維持肝細(xì)胞存活率的作用。
　　 5、FSP對肝組織內(nèi)TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)水平影響
　　 通過Real Time-PCR技術(shù)檢測

15、了小鼠肝組織內(nèi)TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果為：AFL組與正常對照組比較，小鼠肝組織內(nèi)TNF-a的mRNA表達(dá)水平有所升高，IL-6和IL-10的mRNA水平有所降低，但均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。AFL+FSP組與AFL組比較，TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)水平分別有所下降和升高，但均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。AFL+FSP組TNF-a的mRNA表達(dá)水平較正常對照組也明顯下降(P＜

16、0.05)。
　　 6、FSP對脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-a、IL-6和IL-10含量的影響
　　 經(jīng)FSP處理后，利用ELISA法檢測小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-a、IL-6和IL-10含量，結(jié)果為：AFL組與正常對照組比較，TNF-a和IL-6的水平顯著升高(P值均＜0.01)，IL-10水平也顯示升高，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。AFL+FSP組與AFL組比較，TNF-a的水平明顯下降(P＜0.01)，可降至正

17、常對照組所測得的水平；IL-6和IL-10的水平也顯示下降，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；AFL+FSP組IL-6水平仍明顯高于正常對照組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、FSP能夠降低酒精性脂肪肝小鼠體內(nèi)血脂水平，改善受損肝功能。
　　 2、FSP能夠促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，使酒精損傷的肝組織形態(tài)得到明顯改善。
　　 3、FSP可以下調(diào)血清TNF-a和IL-6水平，從而遏制小鼠酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展；對IL-1