硼替佐米對柔紅霉素誘導(dǎo)的K562耐藥細胞株NF-κB、IκB及P-gp表達的影響.pdf

1、核因子(nuclear factor—kappa B，NF—κ B)是普遍存在于真核細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。正常狀態(tài)下，它與抑制蛋白(inhibitor protein，Ⅰκ B)在細胞漿中結(jié)合。當應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時，Ⅰκ B磷酸化并被蛋白酶體識別降解，NF—κ B被釋放，進入細胞核，與特異的κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)或上調(diào)多耐藥基因(mdrl基因)的表達，其產(chǎn)生的P—糖蛋白(P—glycoprotein，P—gp)是ATP依賴性的藥物泵，可將進入細

2、胞內(nèi)的藥物泵出細胞，使細胞內(nèi)藥物濃度下降，從而出現(xiàn)耐藥。 硼替佐米(PS—341)是蛋白酶體抑制劑類抗腫瘤藥物，臨床主要用于復(fù)發(fā)及難治性多發(fā)性骨髓瘤的治療，在白血病治療方面的應(yīng)用仍處于理論研究和探索階段。本研究采用體外實驗的方法觀察PS—341對柔紅霉素(daunorubicin，DNR)誘導(dǎo)的K562/DNR細胞株NF—κ B、Ⅰκ B及P—gp表達的影響，探討PS—341逆轉(zhuǎn)耐藥的分子機制和作用特點，為臨床克服白血病多藥耐藥

3、提供實驗依據(jù)。 實驗材料： 一、實驗對象 人白血病多藥耐藥細胞株K562/DNR由中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科實驗室友情提供。該細胞株由濃度為0.5mmol/L DNR刺激而成，并維持其耐藥活性。 二、主要儀器和試劑 1、MTT法檢測細胞耐藥性相關(guān)試劑 2、兔抗人NF—κ B、Ⅰκ B及P—gp一抗(美國SANTA CRUZ公司) 3、堿性磷酸酶標記的山羊抗兔和馬抗小鼠二抗(北

4、京中山公司) 4、鼠抗β—actin(美國Sigrna公司) 5、NF—κ B活性試劑盒(美國Active Motif公司) 6、流式細胞儀細胞凋亡檢測試劑盒(北京寶賽) 7、PS—341(西安楊森公司) 實驗方法： 一、細胞培養(yǎng) K562/S、K562/DNR細胞使用含有12％胎牛血清、100U/ml的青霉素和100ug/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5％ CO

5、2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。 二、MTT法進行耐藥細胞株的判定 實驗分組：K562/S和K562/DNR組；將細胞質(zhì)量濃度調(diào)整為2×105/mL，在96孔板上接種，每個質(zhì)量濃度設(shè)5個平行孔。72h后，每孔加入MTT(5g/L)20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清，加二甲基亞砜(DMSO)150μL終止反應(yīng)，避光振蕩15min，用全自動酶標儀檢測波長570nm吸光度(A)值，計算生長抑制率和耐藥倍數(shù)。 三、MTT法分析測

6、定PS—341的直接細胞毒活性 具體方法同上，每孔加入不同濃度的PS—3410.4 u g/L、4 ug/L及40 u g/L，以空白對照組的吸光度值作為100％生存率，各濃度組的相對生存率(％)=每實驗組吸光值/空白組吸光值×100％。通過計算求得90％生存率時的PS—341劑量即IC10。選取低于IC10的一個濃度作為PS—341逆轉(zhuǎn)耐藥的實驗濃度。 四、Western blot檢測各組細胞NF—κ B、Ⅰκ B及P

7、—gp表達情況 以100 ug/ml DNR單用或聯(lián)合應(yīng)用0.4 ug/L、4 ug/L及40 u g/L PS—341作用于K562耐藥細胞株36h，以100 ug/ml DNR單用或聯(lián)合應(yīng)用4 u g/L PS—341作用于K562耐藥細胞株12h、24h和36h。取各組1×107細胞，加入反應(yīng)體系，提取細胞的總蛋白并經(jīng)Larry法定量，取50μg蛋白上樣到15％的SDS—聚丙烯酰胺凝膠，電泳。印跡轉(zhuǎn)膜后，用抗NF—κ B、

8、ⅠκB及P—gp抗體和抗β—actin抗體孵育，最后加入相應(yīng)二抗，用顯色劑進行顯色后用凝膠成像儀分析圖像。 五、ELISA法進行NF—κ B活性檢測 核蛋白提取方法及實驗操作步驟按試劑盒(Activemotif公司產(chǎn)品)說明進行。 六、流式細胞儀檢測細胞凋亡率 分別收集各組的細胞，Annexin—Ⅴ—FITC雙染色，流式細胞儀檢測，計算凋亡百分數(shù)，記錄、儲存和分析結(jié)果。 七、統(tǒng)計方法 所有

9、指標以均數(shù)加減標準差表示。用SPSS11.5軟件進行方差分析和各組間率的比較。P<0.05認為差別有顯著性。 實驗結(jié)果： 1、DNR對K562/S組細胞的IC50值為1.16μg/mL，對K562/DNR組細胞的IC50值為50.43μg/mL，耐藥倍數(shù)為43.47。 2、PS—341作用于K562/DNR細胞株的IC10為4 u g/L。即當PS—341濃度低于4 u g/L時，90％細胞存活，可認為此濃度的P

10、S—341本身無直接細胞毒作用。 3、與陰性對照組相比，DNR可誘導(dǎo)NF—κ B表達上調(diào)、活性增強，Ⅰκ B表達下調(diào)，P—gp表達上調(diào)； 4、加用PS—341可顯著抑制DNR誘導(dǎo)的NF—κ B及P—gp表達，降低NF—κ B活性，其作用呈濃度和時間依賴性。 5、與對照組相比，DNR組、40 u g/L PS—341組及DNR聯(lián)合應(yīng)用不同濃度PS—341組，細胞凋亡率明顯增加，而0.4 ug/L PS—341組及4

11、 ug/L PS—341組細胞凋亡率變化不明顯；與DNR處理組相比，加入PS—341后可提高DNR引起的細胞凋亡率，且隨PS—341濃度的增加，細胞凋亡率進一步增加；與40 ug/L PS—341組相比，DNR聯(lián)合40 ug/L PS—341后細胞凋亡率增加；與相應(yīng)DNR組相比，加入PS—341后可提高DNR引起的細胞凋亡率，且隨PS—341作用時間的延長，細胞凋亡率進一步增加。 結(jié)論： 硼替佐米可減少K562/DNR細