葉黃素對食管癌EC9706細胞增殖抑制和誘導(dǎo)分化效應(yīng)及機制研究.pdf

1、背景與目的 惡性腫瘤已成為人類死亡的主要原因之一，每年全世界約有700萬人死于癌癥。食管癌(esophageal cancer，EC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生在食管上皮細胞，其發(fā)病較隱匿、進展快、預(yù)后差，具有顯著的地域性分布差異。在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率位于惡性腫瘤的第六位，在中國則位于第四位。我國是世界上食管癌的高發(fā)國家，世界上709﹪左右的食管癌發(fā)生在我國，是目前世界上死亡率最高的國家之一。積極預(yù)防及治療食管癌對于提高

2、人民的健康水平及促進社會經(jīng)濟的發(fā)展具有重要的意義。雖然經(jīng)過多年的基礎(chǔ)研究和臨床實踐，食管癌患者的生存率并沒有得到根本的改善，EC仍嚴重威脅著人民的生命和健康。因此，尋找行之有效的干擾食管癌發(fā)生和發(fā)展的線索和物質(zhì)成為廣大學(xué)者關(guān)注的重要課題。流行病學(xué)資料顯示，不良飲食為食管癌的誘因之一，并且現(xiàn)已證明人們所攝取的食物中有促癌成分也有抗癌成分，因此尋找食物中的抗癌成份進行食管癌的預(yù)防及治療具有十分重要的意義。食管癌患者常常伴有免疫功能低下，加上

3、手術(shù)創(chuàng)傷等，術(shù)后短期往往不能耐受毒性較大的化療藥物的應(yīng)用。因此，食管癌術(shù)后患者應(yīng)該應(yīng)用一些性質(zhì)較溫和的既具有抗癌作用又能提高免疫功能的藥物。目前，眾多學(xué)者主要著眼于從天然產(chǎn)物中尋找新的化學(xué)藥物。 植物化學(xué)物為植物性食物中天然存在的、含量較少的一類具有抗突變、抗癌或其它生理活性的化學(xué)物質(zhì)。近年來對其的研究成為食品化學(xué)/營養(yǎng)學(xué)在抗腫瘤方面研究的熱點。葉黃素(lutein)是一種天然植物提取物，屬于含氧類胡蘿卜素。國外大量的流行病學(xué)

4、證據(jù)表明，葉黃素在預(yù)防視黃斑退化、阻斷腫瘤、心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展和增強機體免疫力等方面都有著廣泛的生物學(xué)活性。在我國，葉黃素的應(yīng)用僅僅局限于飼料行業(yè)，其生物學(xué)活性和生物學(xué)效應(yīng)研究尚未引起食品和醫(yī)藥行業(yè)的重視。國內(nèi)學(xué)者王明臣等研究證實lutein具有明顯的抗氧化、抗衰老和抗突變等生物學(xué)效應(yīng)。本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，以人食管癌細胞株EC9706細胞作為研究對象，利用生化及分子生物學(xué)技術(shù)，旨在探討lutein對EC9706細胞的增殖抑制

5、和誘導(dǎo)分化效應(yīng)及其分子機制，期望為食管癌的干預(yù)阻斷防治提供新的線索和途徑。 材料與方法 1．常規(guī)培養(yǎng)人食管癌細胞株EC9706細胞，測定并繪制該細胞株的生長曲線及標準曲線。 2．MTT比色法測定EC9706細胞的增殖活性，用不同濃度葉黃素作用EC9706細胞，計算細胞增殖抑制率。 3．HE染色法觀察葉黃素作用后EC9706細胞形態(tài)的改變。 4．酸解DNA甲綠-派朗寧染色并計數(shù)經(jīng)葉黃素作用食管癌分化

6、細胞／增殖細胞的比例，觀察葉黃素對EC9706細胞分化的影響。 5．采用流式細胞法測定葉黃素作用EC9706細胞后細胞周期的改變及凋亡情況；免疫組織化學(xué)法測定葉黃素對EC9706細胞Bcl-2與Bax蛋白表達的影響，以及葉黃素對EC9706細胞周期素Cyclin D1與Cyclin E蛋白表達的影響。 6．所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0 for windows統(tǒng)計軟件分析處理。多組問的比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩

7、兩比較用LSD檢驗，率的比較采用卡方檢驗。P<0.05差異具有顯著性。 結(jié)果 一、葉黃素對人食管癌細胞株EC9706細胞增殖的抑制作用 1．葉黃素對EC9706細胞的形態(tài)學(xué)改變 1.1倒置顯微鏡下活細胞觀察：葉黃素高濃度組細胞濃度下降，除部分細胞體積縮小，胞漿胞核濃縮外，多數(shù)細胞變形，呈現(xiàn)梭形改變。隨葉黃素濃度及作用時間的增加，細胞毒性改變更趨明顯。 1.2 HE染色光學(xué)顯微觀察：鏡下觀察可見陰

8、性對照組EC9706細胞較圓，核顯藍紫色深染，胞漿淡藍紫色，細胞核大，胞漿少，胞核比增大，呈現(xiàn)典型惡性腫瘤細胞特征；而葉黃素處理組細胞多呈橢圓形或不規(guī)則形，大部分核深染程度較輕，胞漿多且淡染，呈淺紫紅色，細胞核小，核漿比增大，個別發(fā)生空泡變性。細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)梭形細胞等上皮細胞形態(tài)，提示葉黃素誘導(dǎo)其成熟分化，細胞惡性程度降低。 2.葉黃素對EC9706細胞生長曲線的影響陰性對照組食管癌細胞的生長曲線隨著時間的延長呈現(xiàn)

9、顯著的上升趨勢。而不同濃度葉黃素組處理EC9706細胞一定時間后細胞的生長曲線均明顯低于陰性對照組(P<0.05)，呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性。其中80μg/ml和160μg/ml葉黃素組96h食管癌細胞的存活率分別為57.77﹪和45.57﹪。 3.葉黃素對EC9706細胞增殖指數(shù)(PI)的影響與陰性對照組相比，葉黃素作用EC9706細胞96h后，各劑量組的細胞增殖指數(shù)明顯降低(P<0.05)，并呈時間和劑量依賴性。

10、二、葉黃素對人食管癌細胞株EC9706細胞分化的誘導(dǎo)作用葉黃素干預(yù)處理EC9706細胞72、96h后，酸解DNA甲綠-派朗寧染色顯示，和陰性對照組相比，葉黃素組增殖型細胞明顯降低(P<0.05)，并且增殖型細胞/分化型細胞的比值隨著葉黃素濃度的升高而降低。 三、葉黃素對人食管癌細胞株EC9706細胞周期阻滯作用 1.葉黃素作用后EC9706細胞周期的改變從細胞周期各時相分布來看，經(jīng)葉黃素各組作用后，G<,0>/G<,1>

11、期細胞比例明顯增多，而S期細胞比例逐漸減少，G<,2>/M期細胞分布比例也有減少的趨勢。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示葉黃素各組對EC9706細胞系的細胞周期均有明顯影響(P<0.05)。 2．葉黃素作用后EC9706細胞周期素Cyclin D1與Cyclin E的表達葉黃素處理EC9706細胞96h后，經(jīng)過免疫組化測定，食管癌細胞Cyclin D1蛋白表達降低，而陰性對照組表達水平較高，兩者相比差異具有顯著性(P<0.05)；Cyclin

12、E蛋白在陰性對照組食管癌細胞中表達水平較高，經(jīng)葉黃素干擾處理的EC9706細胞中Cyclin E表達明顯降低，統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性意義(P<0.01)。 四、葉黃素對人食管癌細胞株EC9706細胞的凋亡誘導(dǎo)作用 1．DNA倍體分析葉黃素作用后EC9706細胞96h后，葉黃素組：EC9706細胞在流式細胞儀DNA直方圖上可見明顯的亞二倍峰體(凋亡峰，Ap)，而陰性對照組在二倍體峰前見微量亞二倍體峰。 2．葉黃素作用

13、后EC9706細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達實驗中葉黃素處理組與陰性對照組Bcl-和Bax蛋白均有表達，96h后，對照組Bcl-2蛋白表達的細胞數(shù)量多，顏色深，呈強表達，而葉黃素處理組陽性細胞表達色澤淺，呈弱表達，對照組與葉黃素處理組差異有顯著性(P<0.05)，表明葉黃素可以下調(diào)食管癌EC9706細胞Bcl-2蛋白的表達。而正常對照組少數(shù)細胞Bax蛋白表達且色澤淺，呈弱表達，葉黃素組表達的細胞數(shù)量多，顏色深，呈強表達，對照組與葉黃素

14、處理組有顯著性差異(P<0.05)，揭示葉黃素誘導(dǎo)EC9706細胞Bax蛋白的表達。 結(jié)論 1．MTT試驗結(jié)果提示葉黃素在體外具有抑制人食管癌細胞株EC9706增殖的作用，且具有時間劑量依賴性。 2．HE染色以及酸解DNA甲綠—派朗寧染色顯微鏡下觀察提示葉黃素可以誘導(dǎo)人食管癌細胞株EC9706細胞分化。 3．流式細胞術(shù)分析顯示，葉黃素可以明顯干預(yù)人食管癌細胞株EC9706細胞的增殖周期，將EC9706細胞