狂犬病病毒受體NCAM、P75和nAchR的原核表達、多克隆抗體的制備以及病毒感染對細胞受體的影響.pdf

1、狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)是彈狀病毒科狂犬病毒屬的成員,具有高度的嗜神經(jīng)性并且能引起致命的腦炎。目前沒有有效的治療方法,病死率幾乎100％?？袢〔《揪幋a五種蛋白,其中 G蛋白在決定病毒的宿主范圍、嗜神經(jīng)毒力、病毒的免疫原性及與宿主細胞表面受體分子的相互作用等方面起著重要的作用。病毒的細胞受體是病毒侵入靶細胞的門戶,能與病毒特異性的結(jié)合,介導(dǎo)病毒入侵易感宿主細胞而啟動其復(fù)制過程。RV在侵入神經(jīng)肌肉接頭時,位于突觸后膜的

2、nAchR和位于突觸前膜的NCAM起到重要的介導(dǎo)作用。神經(jīng)營養(yǎng)素受體P75同樣作為狂犬病病毒的一個受體,當(dāng)病毒進入神經(jīng)元細胞后,P75可與狂犬病病毒 G蛋白結(jié)合從而使病毒進入細胞漿內(nèi)進行逆向傳遞。
　　本課題從感染Flury毒株1 h的NA細胞中抽提總RNA,從總RNA中合成并克隆了NCAM、P75和nAchR基因,將這些基因片段插入原核表達載體pET-32a(+)克隆位點,并成功構(gòu)建了pET-NCAM-711、pET-P75-5

3、13和pET-nAchR-525的重組原核表達質(zhì)粒。將這些原核重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入原核表達宿主菌BL21(DE3)中,分別經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)而表達NCAM-711、P75-513和nAchR-525三種重組蛋白。SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn),表達的三種重組蛋白 NCAM-711、P75-513和nAchR-525分別表達出52、45和47 KD的融合蛋白,同時證實,NCAM-711和nAchR-525主要以包涵體的形式表達,而P75-51

4、3則主要以可溶性蛋白的形式表達。分別經(jīng)過Ni-NTA樹脂純化重組蛋白,以純化的重組蛋白為抗原與弗氏佐劑乳化免疫小鼠,制備NCAM、P75和nAchR多克隆抗體。
　　由于自然狀態(tài)下這三個受體在細胞表面的表達量很低,常規(guī)方法 IFA和WB等的反應(yīng)很弱,難以達到檢測標(biāo)準(zhǔn),因此分別構(gòu)建了三個受體的真核表達質(zhì)粒 NCAM-1818-3.0、P75-1284-myc和nAchR-1509-myc。轉(zhuǎn)染BHK-21細胞,獲得過表達NCAM、P

5、75和nAchR三個蛋白的BHK-21細胞。
　　分別以正常的NA細胞以及真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細胞24 h后收集的細胞和細胞蛋白為樣品,用IFA和Western-blot方法檢測細胞表面的受體蛋白與抗體的反應(yīng)性。IFA結(jié)果表明,制備的NCAM、P75和nAchR多克隆抗體分別與NA細胞上的三種受體結(jié)合都顯示特異性熒光。Western-blot結(jié)果表明,制備的抗NCAM和P75蛋白的兩種多克隆抗體可與相應(yīng)的細胞轉(zhuǎn)染受體蛋白N

6、CAM和P75反應(yīng),而nAchR多克隆抗體可與NA細胞及轉(zhuǎn)染BHK-21細胞上的nAchR結(jié)合,IFA可看到熒光,但用Western-blot的方法檢測不到細胞表面的nAchR蛋白。
　　應(yīng)用制備的三種受體蛋白多抗用流式細胞術(shù)測定三種細胞 NA、BHK-21和RAW264.7感染RC-HL株后,NCAM、P75和nAchR三種受體蛋白的表達變化情況。結(jié)果顯示,三種受體蛋白在NA細胞和BHK-21細胞中上調(diào)約2倍左右,但在RAW26

7、4.7細胞中的表達較接毒前上調(diào)更加顯著,分別上調(diào)8、9和6.3倍。
　　在此基礎(chǔ)上用實時熒光定量PCR在mRNA水平上測定NA、BHK-21和RAW264.7細胞感染RV弱毒毒株RC-HL后NCAM、P75和nAchR這三個受體的表達情況。結(jié)果表明,RC-HL感染24 h后NCAM、P75和nAchR三種基因的mRNA都有不同程度的上調(diào)。NCAM、P75和nAchR的mRNA的表達相對于接毒前,NA細胞中分別上調(diào)79.3、28.2

8、和8.7倍,BHK-21細胞中分別上調(diào)3.5、1.9和1.8倍和RAW264.7細胞中分別上調(diào)10.97、9.1和3.5倍。
　　通過擴增三種受體基因并克隆構(gòu)建原核表達載體后進行蛋白純化,成功制備了三個受體的多克隆抗體;三種受體抗體與三種受體蛋白均有特異反應(yīng)性;用制備得到的三種受體多抗檢測三種細胞感染RV后,證實三種受體蛋白表達上調(diào);RV感染后同樣可以誘導(dǎo)這三種受體基因 mRNA表達上調(diào),與蛋白水平結(jié)果一致。表明在狂犬病病毒感染的