水禽呼腸孤病毒感染番鴨肝臟的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、水禽呼腸孤病毒病包括番鴨呼腸孤病毒病（俗稱“番鴨肝白點(diǎn)病”，Muscovy duck reovirusis，MDR）和新型鴨呼腸孤病毒病（俗稱‖鴨出血壞死性肝炎‖，Novel duck reovirusis， NDR）均是近年我國(guó)新出現(xiàn)的危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要疫病，但這兩者的致病性差異較大，致病差異機(jī)理不明。本研究首次應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)分別研究MDRV和NDRV感染雛番鴨的肝臟蛋白質(zhì)組差異，為深入研究?jī)煞N病毒之間的致病機(jī)理奠定良好理論基礎(chǔ)。<

2、br>　　1.番鴨人工感染實(shí)驗(yàn)
　　4日齡健康番鴨隨機(jī)分成MDRV感染組、NDRV感染組和正常對(duì)照組，同等條件下隔離飼養(yǎng)。其中MDRV感染組腿肌接種0.2mL MDRV細(xì)胞毒；NDRV感染組腿肌接種0.2mL NDRV細(xì)胞毒；正常對(duì)照組腿肌接種0.2mL Hank’s液。分別采集接種病毒/Hank’s液1、3、4、5、6d后的肝臟并凍存于-70℃，同時(shí)觀察記錄肝臟的病理變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在攻毒后第3d兩組番鴨肝臟都出現(xiàn)輕微病變和癥狀，

3、第5d MDRV組番鴨肝臟見(jiàn)大量白色壞死點(diǎn)，NDRV組番鴨肝臟見(jiàn)大量出血點(diǎn)/斑或出血灶，本研究選用攻毒后病變最典型的第5d番鴨的肝臟為樣品。
　　2.番鴨肝臟二維雙向凝膠電泳條件的建立和優(yōu)化
　　本研究對(duì)不同裂解液、不同上樣量和相應(yīng)的聚焦程序進(jìn)行優(yōu)化，確立了番鴨肝臟二維雙向電泳凝膠技術(shù)：研磨-超聲-裂解液(7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，65mM DTT，40mM Tris-base，0.5% IPG buffer)法提

4、取肝臟蛋白質(zhì)；上樣時(shí)使用2D clean-up kit以及去拖尾DeStreak試劑；上樣量為1100μg；一向等電聚焦程序?yàn)椋?0V12 h、200V1.5 h、500V1 h、1000V1 h、8000V3 h、8000V60000 Vh、500V10h；采用膠體考馬斯亮藍(lán)染色方法染色。
　　3.MDRV和對(duì)照組之間的番鴨肝臟差異蛋白質(zhì)
　　通過(guò)二維雙向凝膠電泳技術(shù)和PDQest8.0軟件分析獲取49個(gè)MDRV試驗(yàn)組與對(duì)

5、照組之間的差異表達(dá)蛋白，之后運(yùn)用 MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀得到這些膠點(diǎn)蛋白的質(zhì)量譜圖，最后運(yùn)用蛋白質(zhì)搜索鑒定軟件Mascot2.3.02鑒定蛋白，結(jié)果共鑒定出38個(gè)差異表達(dá)蛋白，包括10個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白、17個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白、7個(gè)僅在正常番鴨肝臟里表達(dá)的蛋白和4個(gè)僅在感染MDRV的番鴨肝臟里表達(dá)的蛋白。
　　4.NDRV和對(duì)照組之間的番鴨肝臟差異蛋白質(zhì)
　　步驟同3，獲取32個(gè)NDRV試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異表達(dá)蛋白

6、，進(jìn)一步鑒定后共有26個(gè)，包括9個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白、12個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白、3個(gè)僅在正常番鴨肝臟里表達(dá)的蛋白和2個(gè)僅在感染NDRV的番鴨肝臟里表達(dá)的蛋白。
　　5.MDRV和NDRV的番鴨肝臟差異蛋白點(diǎn)分析
　　由于鴨的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)信息不全，因此本研究運(yùn)用NCBI下載的鳥(niǎo)綱蛋白庫(kù)構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)、GO數(shù)據(jù)庫(kù)和Panther Classification System數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上面兩組共64個(gè)蛋白展開(kāi)進(jìn)一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白都是

7、預(yù)測(cè)蛋白，其中有4個(gè)未知蛋白。兩組可以進(jìn)行亞細(xì)胞定位的蛋白分別占16.22%、3.70%。對(duì)差異表達(dá)蛋白的分子功能分析發(fā)現(xiàn)，MDRV組和 NDRV組中具有結(jié)合功能和具有催化活性的蛋白最可能受到番鴨呼腸孤病毒感染的影響，肝臟中的代謝和抗氧化活性的變化可能是發(fā)病番鴨肝臟特點(diǎn)之一。
　　分析MDRV組和NDRV組中的差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)MDRV組中的蛋白主要反映神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉細(xì)胞受到損傷，而 NDRV組中的蛋白主要反映肝細(xì)胞受損。兩組都有