弓形蟲單克隆抗體的制備及生物學(xué)活性的初步鑒定.pdf

1、剛地弓形蟲(T.gondii)是一種全球性的人畜共患寄生蟲，該種寄生蟲病的流行與傳播不僅嚴(yán)重地影響著畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，同時也對人類的生命與健康造成嚴(yán)重的威脅及危害。本實驗?zāi)康脑谟诶梅肿由飳W(xué)中的蛋白表達(dá)技術(shù)及單克隆抗體的制備等分子及免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)，選用弓形蟲速殖子抗原及膜表面主要致病性抗原P30作為免疫原，制備出弓形蟲單克隆抗體為接下來建立弓形蟲病快速、簡便診斷方法和進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。
　　 通過對弓形蟲P30基因的PC

2、R擴(kuò)增、克隆、測序，成功的構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a-P30，并成功的誘導(dǎo)表達(dá)了弓形蟲P30重組蛋白抗原，經(jīng)純化制備出了可溶性弓形蟲P30重組蛋白抗原。同時采用小鼠腹腔收集弓形蟲速殖子方法，用胰蛋白酶法純化制備了弓形蟲速殖子抗原，為后續(xù)試驗提供了免疫抗原。
　　 用弓形蟲P30重組蛋白抗原和弓形蟲速殖子抗原分別免疫小鼠、經(jīng)細(xì)胞融合，利用建立的間接ELISA方法對融合胞融克隆進(jìn)行檢測篩選，成功的用表達(dá)的P30蛋白制備了2株

3、單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞分別命名為5：D5、2A1；用速殖子抗原制備了2株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，分別命名為586、2D2。
　　 對這4株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定：經(jīng)間接ELISA測定5：B6、2D2、5D5、2A1四株雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體上清的效價分別為：1:800、1:1600、1:3200、1:6400；腹水效價分別為：1:104、1:104、1:105、1:105；經(jīng)單克隆抗體亞型鑒定，4株單克隆抗體

4、586、2D2、5D5、2A1亞型分別為：Ig G1，Ig M，Ig G1和Ig M；染色體計數(shù)結(jié)果顯示：4株雜交瘤細(xì)胞染色體計數(shù)為90～110條，均大于親本細(xì)胞；經(jīng)間接ELISA檢測和SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，四株雜交瘤細(xì)胞第一代、第十代細(xì)胞培養(yǎng)上清OD450值差異不顯著，均能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。
　　 廣西地區(qū)是人畜弓形蟲病流行的地區(qū)，本實驗成功的制備了抗弓形蟲速殖子抗原和弓形蟲P30重組蛋白抗原的單克隆抗體，并對其生物