雞奇異變形桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究.pdf

1、雞奇異變形桿菌?。≒roteus mirabilis disease）是近年來國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種急性熱性細菌性傳染病。本病的特征是呼吸困難、咳嗽、體溫升高、腹瀉。病雞主要表現(xiàn)為菌血癥、敗血癥，一側(cè)性或兩側(cè)性癱瘓或水樣腹瀉，各種日齡的雞群都可感染本病，但以7周齡以下的雛雞最易感。種雞感染本病后可通過種蛋傳給后代，從而造成雛雞的大批死亡。此病十分容易造成爆發(fā)性流行疾病，對養(yǎng)殖業(yè)是一種潛在的威脅。孫秋艷等曾采用自制奇異變形桿菌診斷抗原，對來自于

2、河南、安徽、山東、廣西等?。ㄗ灾螀^(qū)）的血清進行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明奇異變形桿菌抗體陽性率普遍較高。
　　 目前，奇異變形桿菌的檢測多采用傳統(tǒng)的分離鑒定方法。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，有國外學(xué)者對奇異變形桿菌的PCR檢測方法做過相關(guān)的研究。國內(nèi)2008年首次有相關(guān)報道，但到目前為止，國內(nèi)關(guān)于雞奇異變形桿菌的PCR及16srRNA等分子方面的檢測還未見報道。
　　 近年來實驗證明，細菌細胞膜中的一種重要組成成

3、分外膜蛋白（OMP）具有良好的免疫原性，不僅可刺激體液免疫，而且也可刺激細胞免疫作用。因此本試驗通過對分離菌QY進行常規(guī)等綜合鑒定，確定分離的QY為奇異變形桿菌，又進一步對其16SrRNA基因序列進行測定及分析，建立了系統(tǒng)進化樹。提取了雞奇異變形桿QY的OMP，對其免疫原性進行試驗；同時用OMP制備了兔抗雞奇異變形桿菌OMP高免血清，建立了標(biāo)記抗體檢測方法，為快速檢測雞奇異變形桿菌病原或抗體奠定了基礎(chǔ)。本研究主要包括以下內(nèi)容：
　

4、　 一、雞奇異變形桿菌分離鑒定及16SrRNA基因序列測定、系統(tǒng)進化分析
　　 從山東泰安一雞場發(fā)病雛雞分離到一株致病菌QY，通過細菌形態(tài)學(xué)等常規(guī)鑒定符合奇異變形桿菌特性。用奇異變形桿菌診斷抗原血清學(xué)診斷結(jié)果呈陽性，人工感染證明該菌株是造成該場雛雞大批發(fā)病死亡的致病菌。藥敏試驗結(jié)果顯示對頭孢類、恩諾沙星等高度敏感，而對青霉素和復(fù)合磺胺等不敏感。以細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，得到QY的16S rRNA基因序列

5、，長約1453bp（GenBank登錄號為GU477712）。將該序列與GenBank中序列進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與其匹配度最高的均是奇異變形桿菌各株系的16SrRNA序列，均高達98％以上。運用DNAStar軟件與其中10株奇異變形桿菌分離株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明QV株與10個代表菌株的同源性均在98.9％-99.9％之間，其中與AB272366同源性最高為99.9％。從分子水平證明該菌是奇異變形桿菌并分析了其遺傳進化規(guī)律，為雞奇

6、異變形桿菌的鑒定及其疾病的診斷與治療提供了參考。
　　 二、雞奇異變形桿菌外膜蛋白提取及免疫原性的檢測
　　 采用改良的方法提取了雞奇異變形桿菌QY的OMP，通過測定其含量為5.74.1mg/mL，采用凝膠層析柱分離純化方法獲得分子量為43.0KD的QY有效保護抗原成分（OMP43.0），制備油乳劑QY全菌和OMP抗原、OMP43.0抗原，分別免疫1日齡雛雞兩組。其中一組分別測相應(yīng)抗體水平并分析抗體動態(tài)變化；另一組在免疫

7、14d后，用100 LD50的QY攻毒，統(tǒng)計保護率。結(jié)果免疫后7d時，抗體水平開始逐漸上升，42d時，抗體水平分別達到最高，然后逐漸下降，70d時仍保持較高的抗體水平。主動免疫時，OMP和OMP4.3.0免疫組均得到較高的保護，高于QY全菌免疫組。OMP、OMP43.0和全菌抗原均具有良好的免疫原性和免疫保護作用，為奇異變形桿菌OMP亞單位疫苗的研制奠定了良好的理論基礎(chǔ)。
　　 三、雞奇異變形桿菌OMP高免血清的制備及標(biāo)記抗體檢

8、測方法的建立
　　 將提取的雞奇異變形桿菌OMP免疫健康新西蘭家兔，每周免疫1次，共計免疫4次，獲得了兔抗雞奇異變形桿菌OMP高免血清，建立了檢測雞奇異變形桿菌的間接IFA和ELISA的方法，并對其工作條件進行了優(yōu)化和篩選，試驗結(jié)果表明IFA兔高免血清稀釋度為1:160，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG稀釋度為1:40，感作時間為45min，雞奇異變形桿菌特異性黃綠色熒光最清晰，非特異性熒光最弱。間接ELISA抗原、抗血清最佳工作濃度分