水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法的研究.pdf

1、1.探討了水牛精子質(zhì)膜的完整性、破損精子質(zhì)膜的方法、洗精液和注射溫度對(duì)水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因(ICSI-Mediated Gene Dansfer,ICSI-Tr)效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)以凍融方法破損精子質(zhì)膜組早期胚胎基因表達(dá)率為21.8％,顯著高于活精子組的5.1％(P＜0.01),而分裂率、囊胚發(fā)育率均無(wú)顯著差異(P>0.05);(2)以凍融、TritonX100、超聲波三種方法破損精子質(zhì)膜,凍融組的囊胚發(fā)育率(16.7％)最

2、高,且顯著高于TritonX100組(P＜0.01)。同時(shí),凍融組的早期胚胎轉(zhuǎn)基因表達(dá)率亦顯著高于TritonX100組和超聲斷尾組(60.3％比31.7％比18.2％,P＜0.05);(3)以杜氏磷酸緩沖液(Dulbecco'sPhosphate Buffered Saline,DPBS)、精核分離液(Nucleus Isolation Medium,NIM)、細(xì)胞清洗液(Cell Cleaning Medium,CCM)三種不同培養(yǎng)

3、液洗滌水牛精子,DPBS組早期胚胎基因表達(dá)率、囊胚轉(zhuǎn)基因表達(dá)率均顯著低于NIM、CCM組(3.8％比36.4％比46.9％,P＜0.01:0比26.1％比43.8％,P＜0.01),其囊胚發(fā)育率則顯著高于CCM組(21.3％比10.O％,P＜0.05),NIM與CCM組之間各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異;(4)當(dāng)分別在25℃、38℃時(shí)顯微注射,兩組間的轉(zhuǎn)基因效果無(wú)顯著差異,但在38℃注射顯著降低分裂率和囊胚發(fā)育率(69.4％比90.5％,P＜0.

4、01;5.6％比16.8％,P＜0.05)。以上結(jié)果表明,(1)使用ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可獲得表達(dá)EGFP基因的水牛早期胚胎;(2)精子質(zhì)膜是阻礙外源DNA與水牛精子結(jié)合的主要因素,凍融精子質(zhì)膜破損法能有效破損精子質(zhì)膜,有利于外源DNA與精子的結(jié)合,提高轉(zhuǎn)基因效率;(3)不同的洗精液對(duì)水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的效果有影響;(4)注射溫度對(duì)水牛ICSI胚胎的發(fā)育有影響,但對(duì)ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的效果無(wú)影響。
　　 2.探討了外源DN

5、A的濃度、構(gòu)型和制備方法對(duì)水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因效果的影響。將線性pEGFP-N1質(zhì)粒DNA分成0.6、3.0、15.0、75.0μg/mL四個(gè)梯度分別進(jìn)行水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn),結(jié)果顯示,3.0μg/mL組的早期胚胎基因表達(dá)率最高,且顯著高于0.6μg/mL組和75.0μg/mL組(45.3％比26.3％比21.0％,P＜0.05)。同時(shí),3.0μg/mL組囊胚基因表達(dá)率(56.3％)亦最高,且顯著高于75.0μG/mL組(56.

6、3％比12.5％,P＜0.05)。當(dāng)使用環(huán)狀pEGFP-N1質(zhì)粒DNA進(jìn)行水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)時(shí),早期胚胎基因表達(dá)率、囊胚基因表達(dá)率、囊胚發(fā)育率等幾項(xiàng)指標(biāo)與線性。EGFP質(zhì)粒組無(wú)顯著差異(P>0.05)。而使用PCR直接擴(kuò)增CMV-EGFP-SV40-NEO得到的DNA用于試驗(yàn)時(shí),沒(méi)有獲得EGFP表達(dá)的水牛ICSI胚胎。以上結(jié)果表明:(1)外源基因的濃度會(huì)影響水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的效果,pEGFP-N1質(zhì)粒DNA的濃度以3.0μ

7、g/mL為宜;(2)在水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因時(shí),環(huán)狀與線性EGFP質(zhì)粒DNA的效果相當(dāng);(3)用PCR直接擴(kuò)增外源基因片段進(jìn)行水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因得不到表達(dá)結(jié)果。
　　 3.探討了不同激活方法對(duì)水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因效果的影響。ICSI的水牛卵母細(xì)胞用5μmol/L的離子霉素(Ionomycin,Ion)激活處理5min后分成3組,然后分別用10μg/mL放線菌酮(cycloheximide,CHX)培養(yǎng)5h,10μg/mL

8、CHX培養(yǎng)3h后再用2mmol/L的二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培養(yǎng)2h(CHX3hDMAP2h)或用培養(yǎng)液(CM)培養(yǎng)3h后再用2mmol/L6-DMAP培養(yǎng)2h(CM3h-DMAP2h)。結(jié)果顯示,CHX5h組的分裂率、早期胚胎基因表達(dá)率、囊胚發(fā)育率最高,且顯著高于CM3h-DMAP2h組(66.7％比49.5％,P＜0.05;66.7％比40.0％,P＜0.01;22.2％比9.9％,P＜0.05)。ICSI18h后檢查原核形成率

9、,發(fā)現(xiàn)CHX5h和CHX3h-DMAP2h處理組的完整精子頭百分率顯著低于CM3h-DMAP2h處理組(P＜0.05),2原核(PN)百分率則顯著提高(42.4％比23.8％,P＜0.05;44.6％比23.8％,P＜0.01)。此外,還探討了使用還原劑β-巰基乙醇(β-ME)、二硫蘇糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH)減少精核二硫鍵對(duì)水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因效果的影響。在進(jìn)行ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因前,分別用0.5mmol/Lβ-ME、5.0m

10、mol/L DTT、0.25mmol/L GSH預(yù)處理水牛精子1h,以減少水牛精核二硫鍵,結(jié)果顯示β-ME、DTT、GSH預(yù)處理水牛精子對(duì)提高ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的效果不顯著,但GSH能顯著提高2PN的形成率(P＜0.05)。以上結(jié)果表明:(1)在水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因時(shí),Ion聯(lián)合CHX較Ion聯(lián)合6.DMAP激活效果好;(2)在水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因時(shí),還原劑β-ME、DTT、GSH預(yù)處理精子對(duì)提高水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的效果不顯著,

11、但還原劑GSH預(yù)處理精子能顯著提高2PN的形成率。
　　 4.探討了ICSI-Tr生產(chǎn)轉(zhuǎn)Fat-1基因水牛的可行性。首先,構(gòu)建了pPGK1-FAT1-CMV-EGFP載體,并使用該載體進(jìn)行ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)Fat-1基因的研究。通過(guò)熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)情況,確認(rèn)標(biāo)記基因能在水牛ICSI介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的早期胚胎中表達(dá),并確定25μg/mL的pPGK1-FAT1-CMV-EGFP線性質(zhì)粒用于試驗(yàn)時(shí)效果較好。玻璃化冷凍解凍4枚EGFP

12、陽(yáng)性D7囊胚,非手術(shù)移植到發(fā)情同期化處理的2頭受體水牛子宮角,每頭移植2枚胚胎,60天后進(jìn)行直腸孕檢發(fā)現(xiàn)其中1頭受孕。以上結(jié)果表明:(1)載體結(jié)構(gòu)為pPGK1-FAT1-CMV-EGFP的質(zhì)粒通過(guò)ICSI-Tr技術(shù)可獲得了轉(zhuǎn)基因水牛早期胚胎;(2)用線性pPGK1-FAT1-CMV-EGFP質(zhì)粒DNA進(jìn)行水牛ICSI轉(zhuǎn)基因的適宜濃度是25μg/mL;(3)ICSI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)FAT1基因水牛胚胎移植后可妊娠。
　　 5.探討了受精早

13、期卵胞質(zhì)內(nèi)注射外源DNA生產(chǎn)水牛轉(zhuǎn)基因胚胎的可行性。當(dāng)向水牛體外受精(IVF)卵胞質(zhì)內(nèi)注入7.5pl50μg/mL的線性pEGFP-N1質(zhì)粒DNA,結(jié)果顯示,EGFP基因在水牛早期胚胎中得到表達(dá),受精卵卵胞質(zhì)內(nèi)注射的早期胚胎基因表達(dá)率、囊胚基因表達(dá)率與ICSI-Tr無(wú)顯著差異(P>0.05),且IVF7-10h時(shí)注射的分裂率、早期胚胎基因表達(dá)率均顯著高于18-20h(75.0％比57.5％,P＜0.01;49.0％比26.2％,P＜0.

14、05)。當(dāng)向去核水牛卵胞質(zhì)內(nèi)同時(shí)注入pPGK1-FAT1-CMV-EGFP載體DNA與卵丘細(xì)胞,結(jié)果顯示標(biāo)記基因EGFP能在早期克隆胚胎中得到表達(dá),其分裂率、囊胚發(fā)育率均顯著低于ICSI-Tr(63.9％比89.2％,P＜0.01;5.6％比18.3％,P＜0.05),但二者間的早期胚胎基因表達(dá)率和囊胚基因表達(dá)率無(wú)顯著差異(21.7％比31.3％,P>0.05;50.0％比53.0％,P>0.05)。以上結(jié)果表明:(1)水牛IVF受精卵